利用泛素相關(guān)siRNA文庫篩選NF-κB信號通路調(diào)控分子以及對NLRP3炎癥小體調(diào)控機(jī)制的初步探索.pdf

1、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)蛋白，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮不可替代的作用。然而，很多炎癥相關(guān)的疾病以及惡性腫瘤的發(fā)生都與NF-κB的過度激活密切相關(guān)。所以，機(jī)體在一定程度上都會(huì)保持NF-κB信號通路的穩(wěn)態(tài)。在深入研究NF-κB信號通路過程中，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路中的很多關(guān)鍵分子都會(huì)出現(xiàn)多種翻譯后修飾的情況，其中又以泛素化修飾為主。在經(jīng)典NF-κB信號通路激活過程中，RIP1、TRAF2、NEMO等重要

2、的接頭蛋白或激酶都會(huì)發(fā)生泛素化修飾，并且NF-κB的激活依賴于這些蛋白的泛素化修飾。
　　我們的研究目的是發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的重要分子。然而，目前的研究手段基本上是基于蛋白質(zhì)相互結(jié)合。綜合上文，我們以泛素化修飾為切入點(diǎn)，試圖去探索尋找結(jié)合這些泛素化修飾的重要通路分子的蛋白，從而發(fā)現(xiàn)新的NF-κB調(diào)控分子。因此，我們通過生物信息學(xué)分析找到具有親和泛素化鏈的結(jié)構(gòu)域的蛋白，它們可能作用在泛素化修飾從而進(jìn)一步調(diào)控NF-κB的激活。

3、我們通過結(jié)構(gòu)域分析出203個(gè)包含一種或多種泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多個(gè)泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白，并構(gòu)建siRNA文庫。利用這個(gè)siRNA文庫我們篩選出了20多個(gè)可能的NF-κB調(diào)控分子，我們對其中RNF4和UBXN1兩個(gè)基因進(jìn)行了較為深入的研究。
　　通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)我們發(fā)現(xiàn)，敲低RNF4能夠明顯促進(jìn)經(jīng)典NF-κB信號通路的激活，同時(shí)過表達(dá)RNF4能明顯抑制經(jīng)典NF-κB信號通路的激活。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)RNF4能夠抑制TRADD、T

4、RAF2、Myd88、IRAK1和TAK1而非IKKβ介導(dǎo)的NF-κB的激活，同時(shí)RNF4能抑制經(jīng)典NF-κB通路激活過程中的IKKβ磷酸化和IκBα磷酸化降解進(jìn)程。說明，RNF4的調(diào)控作用可能作用在TAK1水平以上。接下來，我們通過質(zhì)譜鑒定到TAK1可能是RNF4的一個(gè)相互作用蛋白，并且通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明RNF4與TAK1-TAB2-TAB3復(fù)合體相互作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)RNF4能介導(dǎo)TAB2的溶酶體途徑降解，并且這個(gè)過程依賴于其泛

5、素連接酶活性。綜上，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)負(fù)調(diào)控經(jīng)典NF-κB信號通路的蛋白RNF4，可能作為維持NF-κB穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
　　對于UBXN1調(diào)控機(jī)制的研究，我們使用類似的技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)UBXN1也是一個(gè)負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路的調(diào)控子。敲低UBXN1促進(jìn)經(jīng)典NF-κB的激活，同時(shí)增強(qiáng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄以及炎性因子的分泌。過表達(dá)UBXN1能劑量依賴的抑制NF-κB的激活。更重要的是，UBXN1與TNFα受體復(fù)合體組分cIAPs相互作用

6、，并且敲低UBXN1能顯著增強(qiáng)TNFR1對cIAP1的招募，說明UBXN1是一個(gè)作用在TNFα受體復(fù)合體水平的調(diào)控分子。
　　另一部分工作是關(guān)于NLRP3炎癥小體調(diào)控機(jī)制的探索。NLRP3炎癥小體屬于機(jī)體固有免疫的范疇，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過程中具有非常重要的作用。NLRP3炎癥小體能被多種病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)所激活。NLRP3炎癥小體在許多疾病的發(fā)生過程中都發(fā)揮重要作用，包括自身炎癥

7、反應(yīng)、Ⅱ型糖尿病和阿茲海默病等。因此，研究NLRP3炎癥小體的激活和調(diào)控機(jī)制可能為將來的炎癥誘導(dǎo)相關(guān)疾病的治療提供新的靶標(biāo)。
　　通過酵母雙雜交，我們發(fā)現(xiàn)一系列可能的NLRP3相互作用蛋白。我們初步探索了其中兩個(gè)蛋白PEX5和FTH1對NLRP3炎癥小體激活的影響。我們發(fā)現(xiàn)PEX5敲低能夠抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的成熟性白介素1β的分泌。同樣，F(xiàn)TH1敲低后能明顯阻礙NLRP3炎癥小體的活性，并且還能抑制ASC寡聚化。以上結(jié)果初