細(xì)胞周期相關(guān)因子CDCA3可能參與負(fù)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路.pdf

1、NF-κB信號(hào)通路參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種病理生理學(xué)過(guò)程。NF-κB信號(hào)通路的激活對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用,并能明顯促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此研究其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
　　NF-κB信號(hào)通路包括多種調(diào)控分子,其中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factor, TRAFs)就是該通路中重要調(diào)節(jié)蛋白之一。TRAFs是胞內(nèi)接頭蛋白,作

2、為NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)通路上游的接頭分子,參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等。已證實(shí)TRAF2,TRAF5及TRAF6參與NF-κB經(jīng)典通路的活化。為進(jìn)一步研究NF-kB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制,我們?cè)谇捌诠ぷ髦杏媒湍鸽p雜交技術(shù),以TRAF2為誘餌質(zhì)粒從成人的肝文庫(kù)篩選其相互作用蛋白,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)因子3(Cell division cycle associated protein3,CDCA3)可能與TRAF2存在相互作用。CDCA3是F b

3、ox蛋白,是細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中所必需的胞質(zhì)蛋白。它通過(guò)與S期激酶相關(guān)蛋白1(S-phase kinase-associatedprotein1,SKP1)、淘汰素(cullin-1)共同參與E3連接酶復(fù)合物的構(gòu)成,與有絲分裂抑制激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員Wee1的泛素化和降解有關(guān),是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的觸發(fā)器,且是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶1(cdk1)/細(xì)胞周期蛋白B(cyclin B)的適當(dāng)激活和細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂必需的。因此 CD

4、CA3與TRAF2的相互作用可能具有重要意義。
　　為進(jìn)一步確認(rèn)CDCA3與TRAF2的相互作用,探討其對(duì)NF-kB途徑的影響,展開(kāi)以下實(shí)驗(yàn)。首先利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),證明了人胚胎腎293(HEK293)細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CDCA3,能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,對(duì)不同細(xì)胞因子刺激的NF-κB轉(zhuǎn)錄激活有抑制作用;在 NF-κB經(jīng)典通路中CDCA3能夠抑制TRAF2及其家族成員TRAF5,TRAF6介導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性;CDCA3

5、也協(xié)同TRAF1,TRAF3抑制NF-κB;CDCA3會(huì)抑制RIP,MYD88,IKKα,IKKβ及p65對(duì)NF-κB的激活,用TNFα刺激后,CDCA3仍能夠負(fù)調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活;這些抑制效應(yīng)有劑量依賴(lài)效應(yīng),這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CDCA3能夠負(fù)調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。為進(jìn)一步在 HEK293細(xì)胞中檢測(cè)CDCA3功能及作用機(jī)制,構(gòu)建了CDCA3 shRNA干涉載體,進(jìn)行了RNA干擾(RNA interference,RNAi)實(shí)驗(yàn),

6、敲低CDCA3后,檢測(cè)了NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性情況,證實(shí)CDCA3敲低后NF-κB活性增高。為研究CDCA3負(fù)調(diào)控NF-kB的機(jī)制,用外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)TRAF2和CDCA3存在相互作用。同時(shí)用酵母雙雜交技術(shù)初步篩選出CDCA3與TRAF1,TRAF2都有相互作用。隨后用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析了CDCA3與TRAFs家族相互作用的特異性,發(fā)現(xiàn)CDCA3分別與TRAF1,TRAF2,TRAF5,TRAF6,甚至IκBα均有相互作用,而與p