細(xì)胞角蛋白8負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生.pdf

1、NF-κB信號通路廣泛參與了多種生物學(xué)過程的調(diào)控,包括細(xì)胞增殖、存活、凋亡、免疫反應(yīng)、炎癥等,該信號通路的異?；罨蓪?dǎo)致多種疾病。角蛋白CK8是中間纖維的組成成分,其過表達(dá)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。前期我們發(fā)現(xiàn)CK8可抑制TNFα誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的活化,提示CK8是NF-κB通路的負(fù)調(diào)因子。本研究對CK8在負(fù)調(diào)控NF-κB通路中的作用及分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究,并探討其負(fù)調(diào)NF-κB通路所介導(dǎo)的生理病理學(xué)意義。
　　本文首先引進(jìn)了

2、CK8-/-小鼠,并對其基因型及表達(dá)進(jìn)行了鑒定。發(fā)現(xiàn)敲除CK8可導(dǎo)致小鼠發(fā)生嚴(yán)重的結(jié)腸炎伴隨結(jié)腸增生,同時多臟器出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤。同時,我們進(jìn)一步利用CK8敲除小鼠從體內(nèi)水平驗(yàn)證了CK8對NF-kB通路的負(fù)調(diào)控作用。利用AOM+DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌模型,評價了CK8敲低小鼠在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用,結(jié)果表明CK8敲低對誘導(dǎo)劑更加敏感,腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD69+T細(xì)胞比例明顯增多,提示CK8敲除可能在結(jié)腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
　

3、　我們進(jìn)一步對CK8負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。利用堿性磷酸酶報告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)CK8可以劑量依賴的方式抑制TNFα誘導(dǎo)的NF-κB信號通路活化;CK8過表達(dá)可抑制TNFα誘導(dǎo)的IκBα磷酸化的影響;EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)CK8可降低NF-kB的DNA結(jié)合能力;RealtimePCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)CK8抑制NF-κB下游靶基因如IL-1α的表達(dá)。此外,還發(fā)現(xiàn)CK8對Toll樣受體5(TLR5)的激動劑鞭毛蛋白CLB502誘

4、導(dǎo)的NF-κB活化也有明顯的抑制作用,并具有劑量依賴效應(yīng);進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CK8對NF-κB通路的抑制作用發(fā)生在IKK復(fù)合體水平。我們還發(fā)現(xiàn)CK8可通過調(diào)控E3泛素連接酶對NEMO的泛素化修飾,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對NF-κB的負(fù)調(diào)控作用。
　　為進(jìn)一步探討CK8負(fù)調(diào)控NF-κB通路的作用機(jī)制,構(gòu)建了人CK8RNAi慢病毒載體,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。為驗(yàn)證CK8敲除小鼠表型的特異性,我們還進(jìn)一步制備了小鼠CK8過表達(dá)慢病毒。
　　綜上,本研究