TLR-NF-κB信號(hào)通路與其負(fù)性調(diào)控因子SIGIRR和IBD的關(guān)系.pdf

1、研究目的： 探討 TLR/NF-κB信號(hào)通路在IBD致病中的作用及其抑制因子SIGIRR對(duì)LPS/TLR致炎信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控的作用機(jī)制。為IBD的治療提供新的靶點(diǎn)和方向。 研究方法： (1)TLR4/NF-κB信號(hào)通路在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜中的變化及其相互之間關(guān)系的研究：采用SP免疫組化二步法檢測(cè)了68例內(nèi)鏡活檢的腸黏膜內(nèi)TLR4和NF-κBP65的表達(dá)。68例包括：UC 53例(根據(jù)Tmelove-Richa

2、rds分級(jí)分為：Ⅰ級(jí)9例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)19例)及正常對(duì)照者15例。 (2)SIGIRR對(duì)巨噬細(xì)胞LPS/TLR信號(hào)通路的影響：①以未轉(zhuǎn)染SIGIRR基因的巨噬細(xì)胞株Raw264.7為SIGIRR低表達(dá)株，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pUNO-mSIGIRR轉(zhuǎn)入Raw264.7細(xì)胞，構(gòu)建SIGIRR高表達(dá)細(xì)胞株；②分以下6組：對(duì)照組1：Raw264.7；對(duì)照組2： Raw264.7+pUNO(空質(zhì)粒)；對(duì)照組3：Raw264.7 ce

3、ll+pUNO—mSIGIRR；實(shí)驗(yàn)組1：Raw264.7 cell+LPS:實(shí)驗(yàn)組2： Raw264.7+pUNO(空質(zhì)粒)+LPS；實(shí)驗(yàn)組3：Raw264.7 cell+pUNO-mSIGIRR+LPS；實(shí)驗(yàn)組在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入lOng/ml LPS培養(yǎng)12h:③用RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞SIGIRR、TLR2、TLR4、MyD88、IRAK—1和TRAF6 mRNA的表達(dá)。 研究結(jié)果： (1)TLR4/NF-κ

4、B信號(hào)通路在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜中的變化及其相互之間關(guān)系的研究：①TLR4和NF-κB P65在Uc患者腸黏膜中的表達(dá)分別為50/53(94.3％)和46/53(86.8％)顯著高于正常對(duì)照者的6/15(40％)和5/15(33.3％)(P＜0.01)，并且隨著病變嚴(yán)重程度加重而增高；②UC患者腸黏膜內(nèi)TLR4和NF—κB p65的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.923，P＜0.01)。 (2)SIGIRR對(duì)巨噬細(xì)胞LPS/TLR信

5、號(hào)通路的影響：①轉(zhuǎn)染了SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞內(nèi)SIGIRR mRNA的表達(dá)為0.470±0.045顯著高于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Raw264.7細(xì)胞(0.210±0.021，0.212±0.027，P＜0.001)。②無(wú)論是轉(zhuǎn)染了還是未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)LPS作用后其SIGIRR mRNA的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(0.114±0.052 VS 0.210±0.021，0.109±0.047 VS 0.21

6、2±0.027，0.302±0.036 VS 0.470±0.045)(P＜0.001)。③LPS對(duì)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞TLR2 mRNA的表達(dá)均無(wú)影響(0.222±0.037 VS 0.218±0.036，0.220±0.039 vs 0.215±0.035.0.217±0.032 vs 0.205±0.029)(P＞0.05)；同時(shí)SIGIRR對(duì)Raw264.7細(xì)胞內(nèi)TLR2 mRNA的表達(dá)也無(wú)影響(P＞0

7、.05)；④無(wú)論是轉(zhuǎn)染了還是未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)LPS作用后其TLR4 mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(0.587±0.103 vs 0.309±0.046，0.564±0.092 vs0.291±0.050，0.558±0.085 vs 0.210±0.062)(P＜0.001)；SIGIRR對(duì)Raw264.7細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA的表達(dá)無(wú)影響(P＞0.05)；⑤未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)L

8、PS作用后其MyD88 mPNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(0.509±0.134 vs0.890±0.144，0.480±0.134 vs 0.974±0.166)(P＜0.001)，而轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞其MyD88 mRNA的表達(dá)在兩組之間無(wú)顯著差異(0.478±0.151 vs0.341±0.130)(P＞0.05)。在LPS作用組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞其MyD88mRNA的表達(dá)(0.341±0.

9、130)顯著低于未轉(zhuǎn)染(0.890±0.144)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(0.974±0.166)的Raw264.7細(xì)胞(P＜0.001)，但在對(duì)照組SIGIRR對(duì)MyD88 mRNA的表達(dá)無(wú)影響(0.5094±0.134，0.480±0.134，0.478±0.151)(P＞0.05)；⑥未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)LPS作用后其IRAK1 mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(0.964±0.208 vs 0.522±0.096，1.

10、042±0.256 vs 0.491±0.121)(P＜0.001)，而轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞IRAK1 mRNA的表達(dá)在兩組之間無(wú)顯著差異(0.440±0.114 vs 0.530±0.134)(P＞0.05)；在LPS作用組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞其IRAK1 mRNA的表達(dá)(0.440±0.114)顯著低于未轉(zhuǎn)染(0.964±0.208)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(1.042±0.256)的Raw264.7細(xì)胞(

11、P＜0.001)，但在對(duì)照組SIGIRR對(duì)IRAK1 mRNA的表達(dá)無(wú)影響(0.522±0.096，0.491±0.121，0.530±0.134)(P＞0.05)；⑦.無(wú)論是轉(zhuǎn)染了還是未轉(zhuǎn)染SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞，經(jīng)LPS作用后其TRAF-6 mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(0.458±0.039 vs0.263±0.051，0.444±0.049 vs 0.268±0.043，0.320±0.061 vs0.247±0.

12、034)(P＜0.001或P＜0.01)；在LPS作用組轉(zhuǎn)染了SIGIRR的Raw264.7細(xì)胞其TRAF-6 mRNA的表達(dá)(0.320±0.061)顯著低于未轉(zhuǎn)染(0.458±0.039)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒(0.444±0.049)的Raw264.7細(xì)胞(P＜0.001)，但在對(duì)照組SIGIRR對(duì)TRAF-6mRNA的表達(dá)無(wú)影響(0.263±0.051，0.268±0.043，0.247±0.034)(P＞0.05)。 結(jié)論：1、

13、UC患者腸黏膜TLR4和NF-κ B p65的表達(dá)均顯著上調(diào)，這可能增加腸上皮細(xì)胞、固有層單個(gè)核細(xì)胞對(duì)腸腔內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素的敏感性，產(chǎn)生過(guò)激的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IBD的發(fā)生。 2、UC患者腸黏膜TLR4和NF—κB p65的表達(dá)隨著患者腸黏膜病理分級(jí)加劇而增加，提示TLR4/NF—κB通路參與了UC的發(fā)生發(fā)展。 3、LPS可顯著抑制巨噬細(xì)胞Raw264.7內(nèi)SIGIRR的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)TLR4和其信號(hào)通路的下游分子(My

14、D88、IRAK—1和TRAF6)的表達(dá)。 4、給予外源性SIGIRR基因可阻斷LPS對(duì)TLR信號(hào)通路的激活，下調(diào)MyD88、IRAK-1和TRAF6的表達(dá)，這可能是其對(duì)TLR信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控機(jī)制之一。 5、給予外源性SIGIRR基因?qū)o(wú)LPS作用的巨噬細(xì)胞Raw264.7的TLR信號(hào)通路無(wú)影響，但是可阻斷LPS對(duì)TLR信號(hào)通路的激活，從而抑制LPS誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)，因此，SICIRR有望作為IBD乃至其它炎癥性疾病