Cbl-b對ORMDL3基因和TLR4-NF-βB通路的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：①在反復(fù)氣喘病人和哮喘動(dòng)物中研究Cbl-b和ORMDL3的表達(dá)以及兩者之間的關(guān)系，進(jìn)一步在細(xì)胞中改變Cbl-b的表達(dá)，探討Cbl-b對ORMDL3表達(dá)的影響及可能機(jī)制；②探討肥大細(xì)胞中過表達(dá)或敲低Cbl-b后TLR4/NF-κB信號通路的變化，分析其可能的分子機(jī)制。
　　方法：用卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠模型，利用定量RT-PCR技術(shù)檢測哮喘小鼠肺組織中ORMDL3基因的表達(dá)。收集正常和反復(fù)

2、氣喘兒童外周血，定量RT-PCR檢測ORMDL3基因和Cbl-b基因的表達(dá)。構(gòu)建Cbl-b的過表達(dá)質(zhì)粒，將包含ORMDL3基因啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒和Cbl-b的過表達(dá)質(zhì)?；駽bl-b的小干擾序列共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再給予IL-4刺激細(xì)胞，通過螢光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)研究改變Cbl-b表達(dá)后ORMDL3啟動(dòng)子活性的變化。在Hela、293-T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Cbl-b過表達(dá)質(zhì)?；駽bl-b的小干擾序列，定量RT-PCR檢測IL-4刺激后細(xì)胞ORMDL3 m

3、RNA的表達(dá)水平。利用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecitation，CHIP)技術(shù)鑒定STAT6與ORMDL3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。在293-T細(xì)胞中過表達(dá)或干擾Cbl-b后，給予IL-4激發(fā)細(xì)胞，Westemblot檢測磷酸化STAT6和總STAT6蛋白的變化。在肥大細(xì)胞中過表達(dá)及敲低Cbl-b，給予LPS刺激細(xì)胞后，利用定量RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量的變化，同時(shí)利用ELISA檢測

4、細(xì)胞上清IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)。為探索Cbl-b是否通過間接影響NF-κB而調(diào)控IL-6和TNF-α的表達(dá)，我們將含有NF-κB-UJC報(bào)告基因質(zhì)粒（多克隆位點(diǎn)插入了NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒)和Cbl-b過表達(dá)質(zhì)?；駽bl-b的小干擾序列共轉(zhuǎn)染肥大細(xì)胞，再與LPS(1 ug/ml)共培養(yǎng)24小時(shí)，收集裂解物測螢光素酶的活性。通過免疫印跡的方法檢測Cbl-b過表達(dá)或小干擾后肥大細(xì)胞內(nèi)磷酸化IκB和JNK以及它們總蛋

5、白水平的變化。
　　結(jié)果：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OVA組小鼠肺組織ORMDL3表達(dá)較生理鹽水對照組明顯升高。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)反復(fù)氣喘兒童外周血Cbl-b的表達(dá)較正常兒童低(mean±s.d.0.0562±0.03294 vs0.1029±0.06454，p＜0.05)，而ORMDL3在反復(fù)氣喘兒童中的表達(dá)量高于正常兒童(mean±s.d.0.0367±0.01061 vs0.0148±0.01063;p＜0.001)，Cbl-b與O

6、RMDL3之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.8127，p＜0.01）。將構(gòu)建成功的Cbl-b過表達(dá)質(zhì)粒或其小干擾序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后利用Western Blot檢測Cbl-b蛋白的變化，證實(shí)Cbl-b過表達(dá)或干擾表達(dá)成功。在A549、293T細(xì)胞中敲低或過表達(dá)Cbl-b后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Cbl-b可抑制IL-4誘導(dǎo)的ORMDL3基因啟動(dòng)子活性，而敲低Cbl-b上調(diào)了ORMDL3的啟動(dòng)子活性，而且敲低Cbl-b后ORMDL3 mRNA表達(dá)量顯著上

7、升，過表達(dá)Cbl-b則引起ORMDL3mRNA顯著下降。（*p＜0.05，**p＜0.01），這表明Cbl-b能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ORMDL3。之后我們在細(xì)胞中過表達(dá)Cbl-b發(fā)現(xiàn)STAT6的磷酸化水平顯著下降，而敲低Cbl-b基因后STAT6的磷酸化蛋白顯著升高。進(jìn)一步的染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(CHIP)證實(shí)與STAT6結(jié)合的基因組DNA中包含ORMDL3啟動(dòng)子區(qū)的STAT6結(jié)合區(qū)域，表明在293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子STAT6能與ORMDL3

8、的啟動(dòng)子結(jié)合。肥大細(xì)胞中過表達(dá)和小干擾Cbl-b后檢測Cbl-b的蛋白表達(dá)，證明過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及小干擾沉默Cbl-b成功。用siRNA-cblb或Cbl-b過表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP-cblb)轉(zhuǎn)染肥大細(xì)胞，同時(shí)與LPS共培養(yǎng)24小時(shí)后，RT-PCR結(jié)果顯示Cbl-b過表達(dá)組的IL-6和TNF-α mRNA明顯低于正常對照組（*P＜0.05，**P＜0.01），而表達(dá)沉默組則較空白組增高(**P＜0.01)。為進(jìn)一步明確Cbl-

9、b是否對肥大細(xì)胞中IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)存在影響，我們過表達(dá)或敲低肥大細(xì)胞Cbl-b表達(dá)，再與LPS共培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞上清ELISA結(jié)果顯示，Cbl-b過表達(dá)組細(xì)胞上清中的IL-6和TNF-α蛋白濃度明顯低于正常對照組(**P＜0.01)，而表達(dá)沉默組則較空白組增高(*P＜0.05)。為探索Cbl-b是否通過間接影響NF-κB而調(diào)控IL-6和TNF-α的表達(dá)，我們在肥大細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染含有NF-κB-UJC報(bào)告基因質(zhì)粒和pEGFP-

10、cblb質(zhì)?；駽bl-b的小干擾序列，與LPS共培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cbl-b過表達(dá)組螢光素酶活性與比對照組相比降低，Cbl-b敲低組與對照組比較升高。說明Cbl-b顯著降低了LPS刺激后肥大細(xì)胞內(nèi)NF-κB-UJC螢光素酶活性（*P＜0.05）。免疫印跡法檢測磷酸化IκB和.JNK水平，發(fā)現(xiàn)磷酸化的IκB和JNK在siRNA-cblb組表達(dá)增高，而在pEGFP-cblb組中則顯著下降。
　　結(jié)論：ORMDL3在哮喘小鼠肺組織中