HO-1-CO通過調(diào)控TLR4-NF-κB修復(fù)膽汁淤積肝損傷腸屏障破壞的研究.pdf

1、膽汁淤積性肝病由肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞損傷及膽管梗阻導(dǎo)致。膽汁淤積時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加且廣泛沉積在肝竇周間隙，肝內(nèi)膠原纖維異常增生而導(dǎo)致肝纖維化，甚至發(fā)展為肝硬化。肝纖維化及肝硬化患者常合并腸道屏障功能障礙，腸道通透性改變；同時(shí)腸道微生態(tài)改變、細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈入血，繼而激活全身炎癥反應(yīng)，引起多個(gè)器官功能障礙。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的全身炎性細(xì)胞因子增加和氧化應(yīng)激又加重腸道和肝損傷，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥。因此保護(hù)腸屏障對于阻止肝病進(jìn)展及

2、預(yù)防并發(fā)癥至關(guān)重要。
　　膽汁淤積性肝纖維化時(shí)，腸道膽汁酸缺如或減少可導(dǎo)致細(xì)菌在腸道內(nèi)過度生長和菌群結(jié)構(gòu)改變。一些致病性、促炎性微生物，如：紫單胞菌科和腸桿菌科過度生長，腸道通透性增加，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和細(xì)菌移位引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重腸屏障損害。腸黏膜屏障作為保護(hù)機(jī)體的第一道防線，可以抵抗腸腔中細(xì)菌、食物抗原、毒素等外源性物質(zhì)的損傷,其中以機(jī)械屏障最為重要，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為完整的腸上皮細(xì)胞及之間

3、的緊密連接（tight junction，TJ）。
　　血紅素在血紅素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）的作用下可生成膽紅素、一氧化碳（Carbon Monoxide，CO）及轉(zhuǎn)鐵蛋白。研究表明，HO-1及其產(chǎn)物在體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用：抗炎、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞凋亡等。近來研究證實(shí)，上調(diào)HO-1對于腸屏障具有保護(hù)作用。內(nèi)源性CO主要依賴HO家族的生成，外源性CO來源較多，其中促一氧化碳釋放分子-2（CO-rel

4、easing molecule-2，CORM-2）是一種過渡金屬羰基化合物，可以不通過機(jī)體代謝而直接釋放出CO。研究證實(shí)，CORM-2作為CO主要釋放分子，可以保護(hù)腸上皮細(xì)胞屏障功能，同時(shí)抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，促進(jìn)緊密連接蛋白恢復(fù)。
　　我們將在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究，通過LPS損傷Caco-2單層細(xì)胞模型，體外實(shí)驗(yàn)觀察鈷原卟啉（cobalt protoporphyrin，CoPP）內(nèi)源性增加HO-1和外源性補(bǔ)充CO對LPS導(dǎo)

5、致的Caco-2細(xì)胞腸屏障損傷具有保護(hù)作用，且主要通過減少上皮細(xì)胞凋亡、恢復(fù)緊密連接蛋白而發(fā)揮作用。同時(shí)構(gòu)建慢病毒包裝的HO-1過表達(dá)及敲低的穩(wěn)定表達(dá)的Caco-2細(xì)胞株，從基因水平上改變HO-1表達(dá)，進(jìn)一步檢測HO-1對核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）及緊密連接蛋白的影響，結(jié)果證實(shí)HO-1高表達(dá)可以通過抑制TLR4/NF-κB表達(dá)，改善LPS誘導(dǎo)的腸緊密連接蛋白破壞和細(xì)胞凋亡。最后通過膽總管結(jié)扎建立膽汁淤積性

6、肝損傷大鼠模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)CoPP和CORM-2治療對大鼠腸屏障具有保護(hù)作用。
　　本課題采用CoPP（內(nèi)源性激活HO-1）、CORM-2（外源性補(bǔ)充CO）及構(gòu)建HO-1過表達(dá)或敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（基因治療）三種不同方式深入研究HO-1/CO對肝纖維化腸屏障損傷的修復(fù)作用，為今后修復(fù)腸屏障藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究共分三部分：
　　第一部分：HO-1和CORM-2對LPS導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞損傷的修復(fù)

7、作用。
　　第二部分：調(diào)控HO-1基因表達(dá)對腸上皮細(xì)胞的影響及機(jī)制研究。
　　第三部分：HO-1和CORM-2對膽汁淤積肝損傷大鼠腸道屏障功能的保護(hù)作用。
　　第一部分 HO-1和CORM-2對LPS導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞損傷的修復(fù)作用
　　目的：
　　腸屏障功能損傷與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括炎癥性腸病及慢性肝臟疾病等。研究表明，酒精性肝病、肝纖維化及肝硬化均存在腸屏障的破壞。肝纖維化進(jìn)展過程中，腸道菌

8、群失調(diào)、腸黏膜通透性增加，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物如LPS等經(jīng)門靜脈入血造成肝臟的“二次打擊”，并形成“腸-肝軸”惡性循環(huán)，加重肝臟和腸道損傷，故修復(fù)腸屏障對于阻斷肝纖維化進(jìn)展至關(guān)重要。HO-1以及其代謝產(chǎn)物CO對腸屏障功能具有保護(hù)作用，本研究體外觀察CoPP和CORM-2對LPS導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞損傷的修復(fù)作用。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)采用Caco-2細(xì)胞作為腸上皮屏障功能研究的體外模型。（1）首先構(gòu)建Caco-2單層細(xì)胞模擬

9、腸上皮細(xì)胞，光鏡下觀察Caco-2單層細(xì)胞形態(tài)，測量跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）及胞旁漏出標(biāo)記物異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐-4000（FD4）的滲透量評估Caco-2細(xì)胞單層的完整性。（2）采用不同濃度LPS刺激損傷腸上皮細(xì)胞，觀察TEER的變化。（3）實(shí)時(shí)半定量qRT-PCR檢測不同濃度LPS刺激后，Caco-2細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1、occludin和cla

10、udin-1 mRNA及蛋白的表達(dá)變化，從而篩選最佳的LPS處理濃度。（4）采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測Caco-2單層細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素6（interleukin6，IL-6）的水平。（5）采用不同濃度CoPP和CORM-2處理Caco-2單層細(xì)胞，CCK8檢測CoPP和CORM-

11、2的細(xì)胞毒性，同時(shí)觀察不同濃度CoPP作用后HO-1及occludin mRNA的變化。依據(jù)HO-1及occludin mRNA的表達(dá)情況，選擇合適的藥物濃度。（6）采用CoPP（20μM,40μM）和CORM-2（50μM,100μM）預(yù)處理Caco-2單層細(xì)胞各1h，然后用LPS（10μg/mL）處理24h。TEER及FD4檢測，觀察CoPP和CORM-2對LPS導(dǎo)致的腸通透性和完整性的保護(hù)作用。（7）Western blot檢測C

12、oPP和CORM-2處理后，緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)。（8）AnnexinⅤ/PI染色檢測Caco-2單層細(xì)胞凋亡，評估CoPP和CORM-2對腸上皮細(xì)胞凋亡的影響。（9）Western blot檢測CoPP和CORM-2預(yù)處理對LPS導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白（caspase3，cleaved caspase3和PCNA）的影響。（10）ELISA檢測CoPP和CORM-2預(yù)處理后，Caco-2單層細(xì)胞

13、上清液中TNF-α和IL-6的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）Caco-2細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2周，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞之間形成致密的細(xì)胞連接；Caco-2細(xì)胞單層的TEER值達(dá)到1000 Q·cm2以上；1mg/ml的FD-4在120min內(nèi)的滲透量（AP-BL側(cè)）無明顯變化，一直處于較低水平（<0.5pmol/cm2），說明細(xì)胞間已形成完整的緊密連接。（2）采用不同濃度的LPS處理Caco-2單層細(xì)胞，TEER檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：和對照

14、組相比，LPS100μg/ml和10μg/ml的濃度下，TEER降低最明顯（P<0.05）。RT-PCR和Western blot檢測不同濃度LPS處理后Caco-2單層細(xì)胞緊密連接蛋白（ZO-1，occludin和claudin-1）mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和對照組相比，LPS刺激可以降低ZO-1，occludin和claudin-1的表達(dá)，其中以10μg/ml時(shí)的損傷作用最明顯。（3）采用不同濃度CoPP處理Caco-2單層細(xì)

15、胞，CCK8檢測結(jié)果證實(shí)5μM-100μM CoPP處理時(shí)，Caco-2細(xì)胞均未出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞數(shù)和對照組相比未見明顯降低。RT-PCR檢測結(jié)果證實(shí)：CoPP濃度在5μM-40μM之間時(shí)，HO-1 mRNA的表達(dá)和CoPP作用濃度呈劑量依賴式增加，當(dāng)CoPP100μM時(shí)HO-1 mRNA的表達(dá)有所下降。occludin mRNA表達(dá)在CoPP40μM時(shí)上升最明顯。（4）采用不同濃度的CORM-2（10μM、50μM和100μM）處理C

16、aco-2細(xì)胞，CCK8檢測其細(xì)胞毒性。結(jié)果證實(shí)CORM-2（10μM-100μM）對細(xì)胞生長無明顯抑制作用。同時(shí)我們檢測了CoPP和CORM-2和LPS聯(lián)合應(yīng)用對Caco-2細(xì)胞生長的影響，結(jié)果證實(shí)LPS與CoPP和CORM-2聯(lián)合應(yīng)用對Caco-2細(xì)胞無明顯損傷和抑制。（5）CoPP和CORM-2預(yù)處理可以保護(hù)Caco-2單層細(xì)胞完整性和腸通透性：TEER及FD4檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和單獨(dú)LPS刺激組相比，CoPP（20μM，40μM）和

17、CORM-2（50μM，100μM）預(yù)處理組TEER值明顯增加，F(xiàn)D4滲出量顯著降低。（6）Western blot結(jié)果證實(shí)：單純LPS刺激組和對照組相比，HO-1表達(dá)增加，ZO-1和occludin蛋白表達(dá)降低。CoPP（20μM，40μM）處理組HO-1的表達(dá)水平較單純LPS刺激組顯著增加，同時(shí)CoPP可以緩解LPS刺激導(dǎo)致的ZO-1和occludin蛋白的損傷。CORM-2處理組和LPS刺激組相比，ZO-1和occludin蛋白表

18、達(dá)也增高。（7）ELISA結(jié)果證實(shí)，LPS刺激可以增加細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，CoPP和CORM-2預(yù)處理組IL-6和TNF-α的表達(dá)較單純LPS刺激組顯著降低。（8）LPS刺激組腸上皮細(xì)胞凋亡較對照組明顯增加，CoPP和CORM-2預(yù)處理可以減輕LPS刺激導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞凋亡，尤其以細(xì)胞早期凋亡為主，同時(shí)Western blot結(jié)果證實(shí)凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3表達(dá)減少，細(xì)胞增殖增加，PC

19、NA蛋白表達(dá)較LPS刺激組顯著增加。
　　結(jié)論：
　　CoPP可以增加HO-1的表達(dá)，上調(diào)HO-1和CORM-2通過抑制上皮細(xì)胞凋亡，阻止腸緊密連接蛋白的破壞，進(jìn)而緩解LPS導(dǎo)致的Caco-2細(xì)胞腸上皮屏障損傷。
　　第二部分調(diào)控HO-1基因表達(dá)對腸上皮細(xì)胞的影響及機(jī)制研究
　　目的：
　　研究HO-1對LPS誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的作用及可能機(jī)制，闡明HO-1對腸上皮細(xì)胞凋亡及緊密連接蛋白的影響；初步探討N

20、F-κB以及特異性抑制劑在其中的作用。
　　方法：
　?。?）設(shè)計(jì)并合成HO-1引物，RT-PCR獲取含有目的基因HO-1的cDNA片段，進(jìn)行酶切及膠回收。（2）將酶切回收產(chǎn)物與FUGW載體連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans5α。（3）設(shè)計(jì)合成HO-1的shRNA引物序列，將引物退火之后連接到PLK0.1載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，之后進(jìn)行涂菌。（4）每個(gè)平板上挑取3個(gè)菌落，搖菌后進(jìn)行測序鑒定。鑒定正確的菌落搖菌后進(jìn)

21、行質(zhì)粒抽提。（5）293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行慢病毒的包裝、收集病毒上清液，然后將攜帶HO-1基因及HO-1shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞。（6）RT-qPCR及Western blot方法檢測Caco-2細(xì)胞中HO-1 mRNA及蛋白的表達(dá)，明確其過表達(dá)及敲低HO-1效果。（7）建立HO-1過表達(dá)及敲低的Caco-2細(xì)胞單層屏障模型，采用LPS損傷Caco-2單層細(xì)胞，免疫熒光、RT-PCR及Western blot檢測Caco-2細(xì)胞

22、緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1、occludin的含量變化。（8）流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測Caco-2細(xì)胞凋亡情況。（9）RT-PCR及Western blot檢測NF-κB p65的表達(dá)及活性。（10）采用NF-κB特異性抑制劑JSH-23處理Caco-2細(xì)胞，觀察緊密連接蛋白、p65及p-p65的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）測序結(jié)果證實(shí)：HO-1基因及HO-1shRNA被成功導(dǎo)入FUGW和PL

23、K0.1載體中，之后將攜帶有HO基因和HO-1shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染至Caco-2細(xì)胞。RT-qPCR及Western blot證實(shí)，轉(zhuǎn)染HO-1基因的Caco-2細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白高表達(dá)，而轉(zhuǎn)染HO-1shRNA的Caco-2細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低。（2）免疫熒光染色結(jié)果顯示：ZO-1和claudin-1蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜，呈蜂巢狀線性分布，在細(xì)胞周圍形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)與周圍細(xì)胞相連接。加入LPS刺激后細(xì)胞

24、膜上claudin-1和ZO-1的熒光信號出現(xiàn)斷裂，呈鋸齒狀分布，且胞漿內(nèi)可見部分染色。（3）RT-PCR及Western blot結(jié)果：HO-1過表達(dá)Caco-2（HO-1組）中ZO-1和occludin的表達(dá)較對照組明顯增加；HO-1敲低組（sh-HO-1組） Caco-2中ZO-1和occludin的表達(dá)較對照組顯著降低。（4）免疫熒光結(jié)果示：HO-1過表達(dá)組給予LPS刺激后，緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)較LPS組增強(qiáng)，而HO-1敲

25、低組LPS刺激對緊密連接蛋白ZO-1的破壞較對照組更顯著。（5）HO-1高表達(dá)組NF-κB p65 mRNA及蛋白的表達(dá)較對照組顯著降低。（6）正常Caco-2細(xì)胞給予CoPP內(nèi)源性激活HO-1或者外源性補(bǔ)充CORM-2可以減弱LPS刺激導(dǎo)致的TLR4/NF-κB p65表達(dá)增加。（7）HO-1+LPS組和control+LPS組相比，細(xì)胞早期凋亡百分比顯著降低；sh-HO-1+LPS組和sh-control+LPS組相比，早期凋亡細(xì)胞

26、百分比明顯增加。（8）LPS刺激時(shí)可以促進(jìn)NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，而HO-1高表達(dá)可以顯著抑制LPS引起的NF-κB的活化。（9） NF-κB抑制劑JSH-23可以抑制NF-κB p65的表達(dá)，同時(shí)腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)較單純LPS刺激組顯著增加。（10）在HO-1敲低的細(xì)胞株中，NF-κB p65和phospho-NF-κB p65蛋白的表達(dá)較HO-1高表達(dá)組顯著增加，尤其是phospho-NF-κB p65蛋白的表達(dá)

27、增高更為顯著，且單純LPS刺激可以顯著增加phospho-NF-κB p65的表達(dá)，而這一效應(yīng)在HO-1高表達(dá)的Caco-2單層細(xì)胞中不是很顯著。
　　結(jié)論：
　?。?）將攜帶HO-1基因及HO-1shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染至Caco-2細(xì)胞，可成功構(gòu)建HO-1高表達(dá)及敲低的Caco-2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。（2）HO-1高表達(dá)可明顯改善LPS引起的Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)及分布，增加ZO-1和occludin的表達(dá)；而敲低HO

28、-1使LPS對Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白的破壞作用加強(qiáng)。（3） HO-1高表達(dá)減少LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡。（4）HO-1高表達(dá)可抑制NF-κB p65的活性，同時(shí)HO-1高表達(dá)抑制磷酸化NF-κB p65的表達(dá)。（5）JSH-23可以抑制NF-κB p65且上調(diào)occludin表達(dá)。（6）正常Caco-2細(xì)胞中采用CoPP內(nèi)源性激活HO-1和外源性補(bǔ)充CO可以減弱LPS刺激導(dǎo)致的TLR4/NF-κB p65表達(dá)，改善腸屏障功

29、能。
　　第三部分 HO-1/CORM-2對膽汁淤積肝損傷大鼠腸屏障的保護(hù)作用
　　目的：
　　觀察膽汁淤積性肝損傷大鼠腸道屏障功能的改變，并探討CoPP內(nèi)源性激活HO-1及補(bǔ)充CORM-2對腸屏障的保護(hù)作用。
　　方法：
　　60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、模型組（bile duct ligation，BDL組）、CoPP治療組、CORM-2治療組、鋅原卟啉（zinc protoporphy

30、rin，ZnPP）治療組。采用膽總管結(jié)扎構(gòu)建BDL大鼠模型，CoPP組、CORM-2組和 ZnPP組造制模方法同 BDL組，在造模2周后，分別給予腹腔注射 CoPP（5mg/kg體重）、ZnPP（5mg/kg體重）和CORM-2（30mg/kg體重），隔日給藥1次，共注射3次。BDL模型組腹腔注射等量的生理鹽水。HE染色觀察肝臟及末段回腸粘膜病理學(xué)改變，血清生化學(xué)檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，A

31、LT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransfemse，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GlutamylTranspeptidase,γ-GT）和總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平。ELISA方法檢測血清內(nèi)毒素、D-乳酸及二胺氧化酶（diamineoxidase，DAO）活性。Western blot檢測HO-1及腸緊密連接蛋白

32、（ZO-1、claudin-1）、凋亡相關(guān)蛋白（caspase3和cleaved caspase3）、PCNA、TLR4及NF-κB p65蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色觀察末段回腸組織ZO-1、claudin-1的分布，ELISA方法檢測血清TNF-α和IL-6水平。
　　結(jié)果：
　　（1）膽總管結(jié)扎可導(dǎo)致膽汁淤積，BDL大鼠血清總膽汁酸水平較假手術(shù)組顯著升高，同時(shí)血清中ALT、AST、AKP及γ-GT的水平均顯著增加。HE

33、染色結(jié)果表明，BDL模型組大鼠匯管區(qū)中度纖維狀增生、炎細(xì)胞浸潤。（2）BDL模型組肝纖維化以2級為主，CoPP組肝纖維化以1級為主，CORM-2治療組肝纖維化程度較BDL組明顯減輕。而 ZnPP組和BDL組相比，肝損傷程度無顯著差別。（3）小腸病理學(xué)檢測結(jié)果示：BDL組大鼠腸上皮細(xì)胞排列紊亂，小腸絨毛中斷且伴粘膜脫落和廣泛炎細(xì)胞浸潤。CoPP組和CORM-2干預(yù)組小腸粘膜形態(tài)相對比較完整，無明顯的粘膜破壞，僅表現(xiàn)為明顯的充血、水腫和炎細(xì)

34、胞浸潤。依據(jù)Chiu’s標(biāo)準(zhǔn)對腸粘膜損傷進(jìn)行評分，BDL模型組腸粘膜損傷程度明顯加重（以2級和3級為主），CoPP組和CORM-2治療組腸粘膜損傷程度較BDL組明顯減輕，尤其CORM-2干預(yù)組腸粘膜損傷顯著緩解。（4）ELISA結(jié)果證實(shí)，BDL模型組和假手
　　術(shù)組相比，內(nèi)毒素及DAO含量明顯增高。CORM-2治療組和BDL組相比，內(nèi)毒素、D-乳酸及DAO含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；CoPP治療組內(nèi)毒素和D-乳酸

35、水平較BDL模型組顯著降低，而DAO水平在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（5） Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，BDL模型組緊密連接蛋白ZO-1和claudin-1表達(dá)明顯下降。CoPP組HO-1蛋白表達(dá)顯著增加，且CoPP和CORM-2治療組ZO-1和claudin-1表達(dá)較BDL模型組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（6）免疫組化染色結(jié)果顯示：BDL組腸上皮細(xì)胞之間連接中斷，claudin-1和ZO-1的染色表達(dá)相對較弱

36、。（7）Western blot結(jié)果顯示：BDL模型組caspase3及cleaved caspase3的表達(dá)顯著增加，cleaved caspase3的上調(diào)尤其顯著。在CoPP和CORM-2治療組，cleaved caspase3的表達(dá)較BDL組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），ZnPP干預(yù)組Caspase3及cleaved caspase3的表達(dá)與BDL組之間無顯著差異（P>0.05）。PCNA的表達(dá)在BDL模型組顯著降

37、低，而CoPP和CORM-2治療組其表達(dá)較BDL組顯著增加，尤以CORM-2組作用為著。（8）Western blot結(jié)果顯示：和假手術(shù)組相比，BDL模型組小腸組織中TLR4及NF-κB p65的表達(dá)顯著增加，CoPP和CORM-2治療組有效減少了TLR4及NF-κB p65的上調(diào)。（9）BDL大鼠腸組織中IL-6的表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加（P<0.05），而CoPP和CORM-2治療組和BDL組相比，IL-6的表達(dá)明顯降低（P<0.05