HO-1基因促進(jìn)緊密連接蛋白Claudin-4表達(dá)增強(qiáng)腸粘膜屏障抗損傷與修復(fù)的作用初步研究.pdf

1、目的:
　　缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是指組織、器官缺血一段時(shí)間后，血管再通，組織器官灌注重新恢復(fù)后，細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而較缺血時(shí)進(jìn)一步加重，器官功能進(jìn)一步惡化的臨床綜合征。研究表明缺血再灌注損傷的早期變化為腸道屏障遭到破壞，腸粘膜通透性增強(qiáng)。上皮細(xì)胞間緊密連接是構(gòu)成腸粘膜屏障的重要組成部分，能夠防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如毒素或細(xì)菌穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)。

2、各種原因引起的腸粘膜屏障的損害是導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂和全身性感染的扳機(jī)。因此腸屏障功能已成為判斷危重病人預(yù)后的重要指標(biāo)，腸道不僅是多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的靶器官，更是MODS的啟動(dòng)者。而眾所周知，血紅素氧化酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）是唯一可以被誘導(dǎo)的血紅素氧化酶，是生物體內(nèi)血紅素分解的限速酶。血紅素降解產(chǎn)生三種產(chǎn)物在抗氧化、細(xì)胞內(nèi)外

3、信息的傳遞以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要的生理功能。研究表明HO-1及其代謝參與體內(nèi)各種氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎、抗凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用。因此有學(xué)者認(rèn)為HO-1是未來(lái)治療胃腸道疾病的重要靶點(diǎn)。本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注損傷模型及腸粘膜屏障體外模型觀察腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白HO-1和Claudin-4蛋白表達(dá)的變化，以進(jìn)一步揭示小腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:
　　采用“腸系膜上動(dòng)脈結(jié)扎60min法”建立

4、大鼠腸缺血再灌注模型，構(gòu)建人HO-1基因過(guò)表達(dá)載體并建立HO-1基因過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為為6組，分別為假手術(shù)組，腸系膜缺血后再灌注3、6、12、24、48h組，每組5只;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組Caco-pS/HO-1和空白對(duì)照組Caco-pS2。采用SYBR Green相對(duì)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)、蛋白免疫印跡法(Western Blot)以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)缺血再灌注損傷后個(gè)時(shí)間點(diǎn)及過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染前后HO-

5、1及Claudin-4 mRNA及蛋白的表達(dá)水;行CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和免疫熒光法觀察HO-1分子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示緊密連接蛋白claudin-4在缺血再灌注后3h后蛋白表達(dá)逐漸升高，于12h達(dá)到最高，隨后逐漸恢復(fù)正常;
　　2.雙酶切及雙向測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建成功，并于Caco-2細(xì)胞內(nèi)WB和PT-PC

6、R證實(shí)。免疫熒光染色后，經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HO-1蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜;
　　3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示:第五天對(duì)照組pS∶3.2500±0.2477實(shí)驗(yàn)組pS/HO-1∶5.4300±0.2497，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于劃痕后48小時(shí)劃痕愈合，而對(duì)照組不愈合。48小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞劃痕平均寬度為分別為(17.25±7.31)vs(126.

7、37±11.14)μm(P＜0.05)。
　　4.HO-1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后，經(jīng)Western Blot檢測(cè)示緊密連接蛋白Claudin-4明顯增加(1.04±0.15)vs(0.50±0.07)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立大鼠小腸缺血再灌注損傷動(dòng)物模型;
　　2.成功構(gòu)建HO-1基因真核過(guò)表達(dá)載體并建立HO-1基因過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株;
　　3.緊密連接蛋白Claudin-