小檗堿對腸黏膜屏障中上皮緊密連接作用的研究.pdf

1、小檗堿（berberine，BBR）又名黃連素，是從我國傳統(tǒng)中藥黃連的根莖中提取出的主要有效成分。長期被臨床用于治療各類腸道感染性疾病，取得了良好的療效。近年來的研究顯示BBR 還具有多種新的藥理作用，如治療糖尿病、降血脂等，適用范圍較廣，已成為傳統(tǒng)中藥藥效成分研究的新熱點。但目前在有關(guān)BBR 研究中，對其作用的傳統(tǒng)靶器官——腸道的應(yīng)用研究卻相對有限。最新的研究提示，BBR 治療腸道疾病仍有較大潛力，尚有許多藥理作用有待挖掘。
　

2、　 腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障組成。機械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由腸上皮細胞與細胞間形成的完整連接。細胞間的連接方式有多種，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接，其中最主要的連接方式是緊密連接。
　　 腸上皮緊密連接的損傷參與了多種疾病的進展。因此，維持完整的腸上皮細胞緊密連接對保護腸屏障功能、防止細菌移位及毒性大分子進入人體有重要的意義。
　　 目前的研究顯示，BBR 具有抑菌、抗炎、抑制腸道腺體分泌

3、和平滑肌收縮的作用，據(jù)此我們推測：BBR對腸上皮細胞緊密連接同樣具有保護作用。
　　 在本研究論文中，我們利用不同緊密連接損傷模型，予以BBR 處理，觀察緊密連接功能、結(jié)構(gòu)以及緊密連接蛋白分布的變化，旨在證實BBR對腸上皮緊密連接的保護作用，并闡明部分機制，為臨床治療腸道疾病提供新的治療策略和理論依據(jù)。
　　 第一部分小檗堿對促炎細胞因子破壞腸上皮緊密連接的保護作用
　　 目的：利用Caco-2細胞建立腸上皮緊密

4、連接的體外模型，并利用腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(IFN-γ)干預(yù)，造成腸上皮緊密連接的破壞。給予BBR 處理，觀察緊密連接結(jié)構(gòu)、功能及緊密連接蛋白分布的變化，證實BBR對緊密連接的保護作用。
　　 方法：建立Caco-2細胞體外緊密連接模型后，利用不同濃度的BBR（25、50、100、200μM）處理72h，研究不同濃度的BBR對Caco-2細胞生長的影響。觀察細胞生長狀態(tài)、測定細胞跨膜電阻抗、LDH釋放法測定細胞活力

5、；確定有效濃度后，實驗分為四組：對照組、BBR處理組、TNF-α+IFN-γ處理組、TNF-α+IFN-γ+BBR處理組。TNF-α+IFN-γ組用100U/ml IFN-γ處理19h后，加入10ng/ml TNF-α至72h；
　　 BBR處理組用有效濃度的BBR處理72h。用EVOM電壓電阻儀測定細胞跨膜電阻抗、透射電鏡觀察緊密連接的超微結(jié)構(gòu)、熒光分光光度計測量單層細胞通透性、Western blot測定緊密連接蛋白在緊密連

6、接膜微區(qū)域中的分布、免疫熒光觀察緊密連接蛋白分布。
　　 結(jié)果：體外實驗表明，100μM以下的BBR能夠呈劑量梯度的增加Caco-2單層細胞的跨膜電阻抗、降低單層細胞的通透性，且對細胞活力無明顯影響；而200μM的BBR對Caco-2細胞則有顯著的細胞毒作用。因此我們選擇100μM作為BBR的有效劑量。分組實驗表明，TNF-α聯(lián)合IFN-γ處理使得Caco-2單層細胞的通透性增加、緊密連接的超微機構(gòu)破壞。BBR能夠一定程度的抑制

7、促炎細胞因子的破壞作用，且這種保護作用可能是通過抑制緊密連接蛋白在胞膜及膜微區(qū)域分布的改變而起作用的。
　　 結(jié)論：一定劑量的BBR能夠降低腸上皮緊密連接的通透性，這部分解釋了BBR的抑制腹瀉作用；BBR對體外促炎細胞因子造成的腸上皮緊密連接損傷具有保護作用，BBR 單獨或聯(lián)合用藥，對炎癥性腸病等患者的腸黏膜屏障有一定的保護作用。
　　 第二部分小檗堿對內(nèi)毒素血癥小鼠腸上皮緊密連接損傷的保護作用
　　 目的：建立

8、內(nèi)毒素血癥小鼠模型，觀察內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下小鼠腸上皮緊密連接的破壞情況；采用BBR 預(yù)處理和短期處理的方式進行干預(yù)，觀察緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的變化，證實BBR對內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下腸上皮緊密連接的保護作用，并探討其作用的機制。
　　 方法：雄性C57BL/6小鼠40只，6-8周，20-25g，隨機分為對照組、BBR 預(yù)處理組、內(nèi)毒素血癥組、BBR 預(yù)處理+內(nèi)毒素血癥組、內(nèi)毒素血癥+BBR 短期處理組共5組，每組8只。BBR 預(yù)處理組采用

9、BBR 灌胃法，劑量為200mg/kg，每天灌胃一次連續(xù)灌胃7天；內(nèi)毒素血癥組采取腹腔注射LPS 法，劑量為10mg/kg；BBR 短期處理組于腹腔注射LPS30min后，給予BBR 200mg/kg 灌胃1次；對照組給予等量的生理鹽水灌胃。腹腔注射LPS12h后，觀察小鼠的眼睛、糞便、毛發(fā)及應(yīng)激反應(yīng)等，進行癥狀評分；采用FITC 標記的葡聚糖觀察腸道通透性的改變；處死小鼠后，取臨近回盲部的部分回腸及結(jié)腸，觀察腸道大體形態(tài)的改變，進行常

10、規(guī)病理、透射電鏡及激光共聚焦顯微鏡檢查。刮取小腸黏膜，采用蔗糖密度梯度離心法提取膜蛋白，Western blot 檢測腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白的分布變化；激光共聚焦顯微鏡觀察MLCK的表達及分布，Western blot 檢測腸黏膜上皮細胞MLCK及胞核內(nèi)NF-κB的表達。數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作單因素方差分析（LSD）；兩組之間的比較采用Dunnettt 檢驗，檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果：內(nèi)毒素血癥組小鼠毛發(fā)

11、粗糙、大便較稀、眼結(jié)膜充血；腸黏膜通透性較對照組顯著增加；常規(guī)病理顯示，腸絨毛萎縮、變短；透射電鏡下觀察到內(nèi)毒素血癥小鼠腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)疏松、橋粒消失；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明緊密連接蛋白表達減少，并從絨毛表面向隱窩移位；Western blot 結(jié)果顯示內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下緊密連接蛋白從不可溶膜組分向可溶膜組分轉(zhuǎn)移。BBR 預(yù)處理組小鼠癥狀評分及病理評分均較內(nèi)毒素血癥組顯著增高，且BBR 預(yù)處理能夠減輕緊密連接的損傷、抑制緊密連接蛋白在

12、腸黏膜表面及膜微區(qū)域的移位；BBR 短期處理對內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下緊密連接的損傷無明顯的保護作用。內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下腸黏膜MLCK的表達增加，NF-κB 從胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；BBR 預(yù)處理能夠抑制內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下MLCK的高表達，抑制NF-κB 從胞漿向胞核轉(zhuǎn)移；BBR 短期處理對這種改變則無明顯影響。
　　 結(jié)論：內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下，腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)及功能均有不同程度的破壞，BBR 預(yù)處理不同程度的減輕了內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下緊密連接的破

13、壞，這種保護作用可能是通過抑制內(nèi)毒素血癥狀態(tài)下腸黏膜表面MLCK的高表達及抑制NF-κB從胞漿向胞核的移位產(chǎn)生的；BBR 短期處理對緊密連接的損傷無明顯保護作用。
　　 第三部分小檗堿對腸缺血再灌注大鼠腸上皮緊密連接的保護作用
　　 目的：建立大鼠腸缺血再灌注模型，觀察腸缺血再灌注狀態(tài)下腸上皮緊密連接的損傷；采用BBR 預(yù)處理的方法進行干預(yù)，觀察腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)及功能的改變，證實BBR對腸缺血再灌注狀態(tài)下緊密連接損傷的

14、保護作用，并闡明其作用的部分機制。
　　 方法：雄性SD大鼠24只，8-10周齡，200-250g，隨機分為4組：對照組、BBR預(yù)灌胃組、腸缺血再灌注組、BBR 預(yù)處理+腸缺血再灌注組。BBR 預(yù)灌胃組劑量為200mg/kg，每天1次連續(xù)灌胃7天；腸缺血再灌注組，采用大鼠動脈夾夾閉腸系膜上動脈的方法，夾閉30min后放開動脈夾，第18h 給予雙糖灌胃（乳果糖13.3mg，甘露醇10.1mg），置于代謝籠中喂養(yǎng)，留取灌胃后6h 全

15、部尿液，采用高壓液相色譜法檢測乳果糖/甘露醇濃度比值；第24h 處死大鼠，分光光度法測定血漿中D 乳酸含量；取臨近回盲部的部分回腸及結(jié)腸，行常規(guī)病理檢查，透射電鏡觀察緊密連接超微結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡觀察緊密連接蛋白的分布及表達。刮取腸黏膜，利用NOS 試劑盒測定腸黏膜中iNOS的含量；利用蔗糖密度梯度離心法提取膜蛋白，Western blot 法檢測腸黏膜上皮緊密連接蛋白在膜微區(qū)域分布的變化。
　　 結(jié)果：腸缺血再灌注組大鼠腸

16、黏膜通透性及血漿中D 乳酸含量顯著高于對照組，腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、高度降低；緊密連接間隙增寬、疏松，橋粒密度降低；激光共聚焦顯微鏡顯示緊密連接蛋白從絨毛表面向隱窩移位；Western blot 結(jié)果顯示腸缺血再灌注組大鼠緊密連接蛋白從不可溶膜組分向可溶膜組分轉(zhuǎn)移；且缺血再灌注大鼠腸黏膜iNOS 含量顯著高于對照組。BBR 預(yù)灌胃能夠顯著改善緊密連接的破壞、降低腸黏膜通透性、降低血漿中D 乳酸含量、抑制緊密連接蛋白在絨毛表面及膜微區(qū)域的移