乳酸菌對(duì)受損腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和生物學(xué)功能的調(diào)控研究.pdf

1、目的和意義： 闡明腸上皮細(xì)胞模型(Caco-2細(xì)胞)在侵襲性大腸桿菌（EIEC）感染后的生物學(xué)功能改變，包括單層細(xì)胞的完整性和通透性、緊密連接（Tight junction ，TJ）蛋白、F-actin的表達(dá)變化及乳酸菌對(duì)EIEC感染腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制研究;闡明乳酸菌對(duì)EIEC對(duì)Caco-2細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控。 研究方法： 1、建立單層Caco-2細(xì)胞感染模型；單層上皮細(xì)胞極性

2、檢測(cè)（堿性磷酸酶染色）；采用免疫金標(biāo)記及電鏡觀察上皮細(xì)胞間緊密連接的位置和超微結(jié)構(gòu)。 2、實(shí)驗(yàn)分組：正常組、感染組、乳酸菌處理組、慶大霉素處理組。用Millipore ERS電阻儀測(cè)定單層細(xì)胞跨膜電阻值(TER)的變化；用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定甘露醇溶液的透過(guò)率間接反映單層細(xì)胞的通透性；采用細(xì)胞免疫組化、免疫熒光、Western blot方法觀察緊密連接（TJ）相關(guān)蛋白Claudin-1蛋白，Occludin蛋白, JA

3、M-1蛋白,ZO-1蛋白的分布和超微結(jié)構(gòu)變化； FITC-phalloidin染色觀察細(xì)胞骨架F-actin的表達(dá)變化；采用基因芯片分析各實(shí)驗(yàn)組間基因表達(dá)的差異；采用2D電泳分析各實(shí)驗(yàn)組間蛋白的差異表達(dá)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析。 所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS 13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1、堿性磷酸酶染色后發(fā)現(xiàn)，腸道上皮樣細(xì)胞Caco-2呈單層分布

4、，具有明顯的極性。免疫膠體金及電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，緊密連接結(jié)構(gòu)位于相鄰上皮細(xì)胞間的頂端，間隙大小約25～38nm。 2、EIEC感染Caco-2細(xì)胞后，單層細(xì)胞的TER值和甘露醇的透過(guò)率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高；而經(jīng)乳酸菌處理后，TER值升高趨緩且甘露醇的透過(guò)率降低，處理組、感染組間與正常組比較，P<0.05。 3、EIEC感染后，相鄰Caco-2細(xì)胞間TJ結(jié)構(gòu)遭到破壞，TJ相關(guān)蛋白（Claudin-1蛋白，Occludin蛋白, J

5、AM-1蛋白,ZO-1蛋白）的表達(dá)亦減少；而乳酸菌處理后可以減輕EIEC引起的TJ結(jié)構(gòu)受損，相關(guān)蛋白表達(dá)增多。 4、EIEC感染后，細(xì)胞骨架F-actin遭到破壞，而乳酸菌處理后F-actin的表達(dá)明顯增多。 5、基因芯片分析各實(shí)驗(yàn)組間基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)：與正常組相比，感染組基因表達(dá)有差異的共137組，其中94組下調(diào)，43組上調(diào)；乳酸菌處理組基因表達(dá)有差異的共91組，其中39組下調(diào)，52組上調(diào)；慶大霉素處理組基因表達(dá)有差異

6、的共138組，其中38組下調(diào)，100組上調(diào)；單純?nèi)樗峋幚砗螅町惐磉_(dá)的基因有15組，其中9組下調(diào)，5組上調(diào)；進(jìn)行差異基因分析。 6、經(jīng)2D電泳分析各實(shí)驗(yàn)組間蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn):感染組與正常組相比，差異表達(dá)的蛋白有30個(gè)，其中11個(gè)表達(dá)減少，19個(gè)表達(dá)增多；乳酸菌處理組與正常組相比，差異表達(dá)的蛋白有25個(gè)，其中11個(gè)表達(dá)減少，14個(gè)表達(dá)增多；乳酸菌處理組與感染組相比，差異表達(dá)的蛋白有15個(gè)，其中5個(gè)表達(dá)減少，10個(gè)表達(dá)增多；采用MA