益生屎腸球菌活菌和熱滅活菌調(diào)節(jié)仔豬小腸黏膜緊密連接蛋白、細(xì)胞因子以及相關(guān)的Toll樣受體的研究.pdf

1、屎腸球菌是仔豬生產(chǎn)中常用的益生菌，但是其作用機(jī)理尚不清楚。為了更充分地了解屎腸球菌對(duì)仔豬小腸黏膜先天防御屏障功能的影響，本研究用屎腸球菌活菌和熱滅活菌對(duì)新生仔豬進(jìn)行試驗(yàn)，并研究它們對(duì)豬腸上皮細(xì)胞的影響。動(dòng)物試驗(yàn)選用窩產(chǎn)仔數(shù)和體重相近、胎次和出生時(shí)間相同的9窩仔豬，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組3窩仔豬。從出生開(kāi)始，對(duì)照組、活菌組和滅活菌組仔豬就分別灌服10％的脫脂乳溶液、含益生屎腸球菌活菌(1×108cfu/mL)的10％脫脂乳溶液和含熱滅活屎腸

2、球菌(1×108cfu/mL)的10％脫脂乳溶液各10 mL，每天一次，連續(xù)6天，仔豬7日齡開(kāi)始飼喂教槽料，21日齡斷奶。記錄仔豬出生、7日齡以及21日齡體重，并統(tǒng)計(jì)教槽前和斷奶前的腹瀉率，并在7日齡飼喂教槽料之前，每窩選擇一頭中等體重的仔豬屠宰，采集腸粘膜樣本，分析相關(guān)指標(biāo)。細(xì)胞試驗(yàn)采用豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞，設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5％ CO2恒溫培養(yǎng)箱中，在IPEC-J2細(xì)胞生長(zhǎng)交匯后，對(duì)照組、

3、LPS組、活菌組、滅活菌組和細(xì)胞壁組分別在無(wú)抗無(wú)血清培養(yǎng)基中加入PBS、LPS(1ng/mL)、益生屎腸球菌活菌(1×108cfu/mL)、熱滅活屎腸球菌(1×108cfu/mL)和細(xì)胞壁(100μ g/mL)，與IPEC-J2細(xì)胞共孵育12 h，分別在1、3、6和12h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.益生屎腸球菌活菌及其熱滅活菌都不影響哺乳期仔豬的體增重，但都能大幅度降低仔豬的腹瀉率，而

4、且活菌組脾臟指數(shù)下降顯著(p＜0.05)。益生屎腸球菌活菌顯著上調(diào)空腸和回腸黏膜的zo-1基因表達(dá)(p＜0.05)，不影響occludin基因表達(dá);但空腸黏膜的occludin和zo-1基因表達(dá)不受熱滅活菌影響，回腸黏膜的這兩種緊密連接蛋白顯著下調(diào)(p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，益生屎腸球菌活菌與熱滅活菌都可提高空腸和回腸黏膜occludin和claudin的蛋白表達(dá)。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)3h內(nèi)，屎腸球

5、菌活菌、熱滅活菌以及其細(xì)胞壁都能上調(diào)zo-1、occludin的表達(dá)水平(p＜0.05)，活菌和滅活菌還上調(diào)了共孵育1h的claudine表達(dá)水平(p＜0.05)，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6h以上時(shí)，緊密連接蛋白的表達(dá)都下調(diào)(p＜0.05)，而LPS對(duì)這三種緊密連接蛋白的基因表達(dá)即使在共培養(yǎng)3h內(nèi)也基本都是顯著下調(diào)作用(p＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，在3h內(nèi)，屎腸球菌活菌可上調(diào)occludin和claudin的蛋白表達(dá)水平，熱

6、滅活菌和細(xì)胞壁組在1h內(nèi)上調(diào)claudin的蛋白表達(dá)量，3h時(shí)與對(duì)照組相比差異不顯著，6h時(shí)活菌與熱滅活菌的緊密連接蛋白表達(dá)量都趨于下降，而LPS組從1h開(kāi)始就下調(diào)occludin和claudin的蛋白表達(dá)水平，蛋白表達(dá)與基因表達(dá)基本一致。
　　2.屎腸球菌活菌顯著上調(diào)仔豬空腸黏膜的il-1、il-6、il-8、tnf-α和tgf-β mRNA表達(dá)水平(p＜0.05)，但是顯著下調(diào)仔豬回腸黏膜的il-1、il-6、il-12和tg

7、f-β的表達(dá)水平(p＜0.05)，不影響空腸黏膜的il-12和回腸黏膜的il-8和tnf-α的表達(dá)量。與活菌不同，熱滅活菌組的空腸黏膜的il-1、il-6、il-8、il-12、tnf-α和回腸黏膜的il-6、il-8、il-12mRNA表達(dá)水平都顯著下調(diào)(p＜0.05)，而空腸黏膜的tgf-β和回腸黏膜的il-1、tnf-α、tgf-β的表達(dá)量則不變。屎腸球菌活菌和熱滅活菌對(duì)仔豬小腸黏膜細(xì)胞因子分泌的影響也有差別?；罹@著促進(jìn)空腸黏膜

8、和回腸黏膜TGF-β以及回腸黏膜IL-8的分泌(p＜0.05)，不影響空腸黏膜IL-8、空腸和回腸黏膜IL-10和TNF-α的分泌量。而熱滅活菌組的空腸黏膜IL-10和TGF-β的分泌量都明顯增加(p＜0.05)，回腸黏膜IL-8、TNF-α和TGF-β的分泌量卻都顯著下降(p＜0.05)，但是空腸黏膜IL-8、TNF-α和回腸黏膜IL-10的分泌量不受影響。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)1h時(shí)，屎腸球菌活菌顯著上調(diào)il-1、il-

9、8、tnf-α和tgf-β mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，但il-6和il-12 mRNA的表達(dá)水平被顯著抑制(p＜0.05);熱滅活菌只顯著上調(diào)了il-6、il-8和tgf-β mRNA的表達(dá)水平(p＜0.05)，而il-1、il-12和tnf-α都不受影響;細(xì)胞壁僅僅顯著下調(diào)了il-8和tnf-α mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，對(duì)il-1、il-6、il-12和tgf-β不影響。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3h時(shí)，屎腸球菌活菌則顯著上調(diào)

10、il-1、il-6、il-8和tnf-α mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，熱滅活菌顯著促進(jìn)il-1、il-6、il-8和il-12的表達(dá)(p＜0.05)，細(xì)胞壁使得il-6和il-12 mRNA的表達(dá)量顯著增加(p＜0.05)，但是卻顯著抑制tnf-α的表達(dá)(p＜0.05)。不管共孵育1h還是3h，屎腸球菌活菌都顯著刺激IPEC-J2細(xì)胞分泌TGF-β，但卻顯著抑制IL-8和IL-10的產(chǎn)生，不影響TNF-α的濃度。而熱滅活菌與IPE

11、C-J2共孵育時(shí)，只是顯著增加1h的TGF-β分泌量，但對(duì)3h的沒(méi)有影響，并顯著減少共孵育1h和3h的IL-8和IL-10產(chǎn)量，對(duì)TNF-α也沒(méi)有影響。
　　3.屎腸球菌活菌組仔豬空腸黏膜的TLR-2和TLR-4以及回腸黏膜的TLR-9基因表達(dá)都顯著上調(diào)(p＜0.05)，但是空腸黏膜的TLR-9以及回腸黏膜TLR-2和TLR-4基因的表達(dá)水平都不受影響;而熱滅活菌組仔豬空腸黏膜和回腸黏膜的TLR-4以及回腸黏膜的TLR-9基因表達(dá)

12、都顯著下調(diào)(p＜0.05)，但是不影響空腸和回腸黏膜TLR-2以及空腸黏膜的TLR-9基因的表達(dá)。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)3h時(shí)，屎腸球菌活菌組和細(xì)胞壁組的TLR-2表達(dá)量都顯著增加(p＜0.05)，但TLR-9的表達(dá)不受影響，而熱滅活菌組和LPS組則都顯著減少TLR-9的表達(dá)量(p＜0.05)，但不影響TLR-2的表達(dá);活菌組、熱滅活菌組以及LPS組都促進(jìn)TLR-4的表達(dá)(p＜0.05)，但是細(xì)胞壁卻顯著抑制TLR-4的表達(dá)