益生屎腸球菌活菌和熱滅活菌調(diào)節(jié)仔豬小腸黏膜緊密連接蛋白、細(xì)胞因子以及相關(guān)的Toll樣受體的研究.pdf

1、屎腸球菌是仔豬生產(chǎn)中常用的益生菌，但是其作用機(jī)理尚不清楚。為了更充分地了解屎腸球菌對仔豬小腸黏膜先天防御屏障功能的影響，本研究用屎腸球菌活菌和熱滅活菌對新生仔豬進(jìn)行試驗(yàn)，并研究它們對豬腸上皮細(xì)胞的影響。動(dòng)物試驗(yàn)選用窩產(chǎn)仔數(shù)和體重相近、胎次和出生時(shí)間相同的9窩仔豬，隨機(jī)分為3個(gè)組，每組3窩仔豬。從出生開始，對照組、活菌組和滅活菌組仔豬就分別灌服10％的脫脂乳溶液、含益生屎腸球菌活菌(1×108cfu/mL)的10％脫脂乳溶液和含熱滅活屎腸

2、球菌(1×108cfu/mL)的10％脫脂乳溶液各10 mL，每天一次，連續(xù)6天，仔豬7日齡開始飼喂教槽料，21日齡斷奶。記錄仔豬出生、7日齡以及21日齡體重，并統(tǒng)計(jì)教槽前和斷奶前的腹瀉率，并在7日齡飼喂教槽料之前，每窩選擇一頭中等體重的仔豬屠宰，采集腸粘膜樣本，分析相關(guān)指標(biāo)。細(xì)胞試驗(yàn)采用豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞，設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃，5％ CO2恒溫培養(yǎng)箱中，在IPEC-J2細(xì)胞生長交匯后，對照組、

3、LPS組、活菌組、滅活菌組和細(xì)胞壁組分別在無抗無血清培養(yǎng)基中加入PBS、LPS(1ng/mL)、益生屎腸球菌活菌(1×108cfu/mL)、熱滅活屎腸球菌(1×108cfu/mL)和細(xì)胞壁(100μ g/mL)，與IPEC-J2細(xì)胞共孵育12 h，分別在1、3、6和12h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，并測定相關(guān)指標(biāo)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.益生屎腸球菌活菌及其熱滅活菌都不影響哺乳期仔豬的體增重，但都能大幅度降低仔豬的腹瀉率，而

4、且活菌組脾臟指數(shù)下降顯著(p＜0.05)。益生屎腸球菌活菌顯著上調(diào)空腸和回腸黏膜的zo-1基因表達(dá)(p＜0.05)，不影響occludin基因表達(dá);但空腸黏膜的occludin和zo-1基因表達(dá)不受熱滅活菌影響，回腸黏膜的這兩種緊密連接蛋白顯著下調(diào)(p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，益生屎腸球菌活菌與熱滅活菌都可提高空腸和回腸黏膜occludin和claudin的蛋白表達(dá)。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)3h內(nèi)，屎腸球

5、菌活菌、熱滅活菌以及其細(xì)胞壁都能上調(diào)zo-1、occludin的表達(dá)水平(p＜0.05)，活菌和滅活菌還上調(diào)了共孵育1h的claudine表達(dá)水平(p＜0.05)，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)6h以上時(shí)，緊密連接蛋白的表達(dá)都下調(diào)(p＜0.05)，而LPS對這三種緊密連接蛋白的基因表達(dá)即使在共培養(yǎng)3h內(nèi)也基本都是顯著下調(diào)作用(p＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，在3h內(nèi)，屎腸球菌活菌可上調(diào)occludin和claudin的蛋白表達(dá)水平，熱

6、滅活菌和細(xì)胞壁組在1h內(nèi)上調(diào)claudin的蛋白表達(dá)量，3h時(shí)與對照組相比差異不顯著，6h時(shí)活菌與熱滅活菌的緊密連接蛋白表達(dá)量都趨于下降，而LPS組從1h開始就下調(diào)occludin和claudin的蛋白表達(dá)水平，蛋白表達(dá)與基因表達(dá)基本一致。
　　2.屎腸球菌活菌顯著上調(diào)仔豬空腸黏膜的il-1、il-6、il-8、tnf-α和tgf-β mRNA表達(dá)水平(p＜0.05)，但是顯著下調(diào)仔豬回腸黏膜的il-1、il-6、il-12和tg

7、f-β的表達(dá)水平(p＜0.05)，不影響空腸黏膜的il-12和回腸黏膜的il-8和tnf-α的表達(dá)量。與活菌不同，熱滅活菌組的空腸黏膜的il-1、il-6、il-8、il-12、tnf-α和回腸黏膜的il-6、il-8、il-12mRNA表達(dá)水平都顯著下調(diào)(p＜0.05)，而空腸黏膜的tgf-β和回腸黏膜的il-1、tnf-α、tgf-β的表達(dá)量則不變。屎腸球菌活菌和熱滅活菌對仔豬小腸黏膜細(xì)胞因子分泌的影響也有差別。活菌顯著促進(jìn)空腸黏膜

8、和回腸黏膜TGF-β以及回腸黏膜IL-8的分泌(p＜0.05)，不影響空腸黏膜IL-8、空腸和回腸黏膜IL-10和TNF-α的分泌量。而熱滅活菌組的空腸黏膜IL-10和TGF-β的分泌量都明顯增加(p＜0.05)，回腸黏膜IL-8、TNF-α和TGF-β的分泌量卻都顯著下降(p＜0.05)，但是空腸黏膜IL-8、TNF-α和回腸黏膜IL-10的分泌量不受影響。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)1h時(shí)，屎腸球菌活菌顯著上調(diào)il-1、il-

9、8、tnf-α和tgf-β mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，但il-6和il-12 mRNA的表達(dá)水平被顯著抑制(p＜0.05);熱滅活菌只顯著上調(diào)了il-6、il-8和tgf-β mRNA的表達(dá)水平(p＜0.05)，而il-1、il-12和tnf-α都不受影響;細(xì)胞壁僅僅顯著下調(diào)了il-8和tnf-α mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，對il-1、il-6、il-12和tgf-β不影響。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3h時(shí)，屎腸球菌活菌則顯著上調(diào)

10、il-1、il-6、il-8和tnf-α mRNA的表達(dá)量(p＜0.05)，熱滅活菌顯著促進(jìn)il-1、il-6、il-8和il-12的表達(dá)(p＜0.05)，細(xì)胞壁使得il-6和il-12 mRNA的表達(dá)量顯著增加(p＜0.05)，但是卻顯著抑制tnf-α的表達(dá)(p＜0.05)。不管共孵育1h還是3h，屎腸球菌活菌都顯著刺激IPEC-J2細(xì)胞分泌TGF-β，但卻顯著抑制IL-8和IL-10的產(chǎn)生，不影響TNF-α的濃度。而熱滅活菌與IPE

11、C-J2共孵育時(shí)，只是顯著增加1h的TGF-β分泌量，但對3h的沒有影響，并顯著減少共孵育1h和3h的IL-8和IL-10產(chǎn)量，對TNF-α也沒有影響。
　　3.屎腸球菌活菌組仔豬空腸黏膜的TLR-2和TLR-4以及回腸黏膜的TLR-9基因表達(dá)都顯著上調(diào)(p＜0.05)，但是空腸黏膜的TLR-9以及回腸黏膜TLR-2和TLR-4基因的表達(dá)水平都不受影響;而熱滅活菌組仔豬空腸黏膜和回腸黏膜的TLR-4以及回腸黏膜的TLR-9基因表達(dá)

12、都顯著下調(diào)(p＜0.05)，但是不影響空腸和回腸黏膜TLR-2以及空腸黏膜的TLR-9基因的表達(dá)。
　　與IPEC-J2共培養(yǎng)3h時(shí)，屎腸球菌活菌組和細(xì)胞壁組的TLR-2表達(dá)量都顯著增加(p＜0.05)，但TLR-9的表達(dá)不受影響，而熱滅活菌組和LPS組則都顯著減少TLR-9的表達(dá)量(p＜0.05)，但不影響TLR-2的表達(dá);活菌組、熱滅活菌組以及LPS組都促進(jìn)TLR-4的表達(dá)(p＜0.05)，但是細(xì)胞壁卻顯著抑制TLR-4的表達(dá)