基于MLCK-MLC信號通路研究腸安Ⅱ號方對腸上皮細(xì)胞緊密連接的分子調(diào)控機制.pdf

1、腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)以腹痛或腹部不適為主要癥狀，排便后可改善，常伴有排便習(xí)慣改變，缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學(xué)和生化學(xué)異常，臨床以腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant IBS，IBS-D)尤為多見。
　　IBS-D發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。近些年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的不斷開展，越來越多的證據(jù)顯示本病的發(fā)生發(fā)展與腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)損傷、腸黏膜通

2、透性增加密切相關(guān)，而該過程可能由腸黏膜免疫系統(tǒng)活化后釋放的促炎細(xì)胞因子直接作用于上皮細(xì)胞緊密連接，下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白表達引起。在促炎因子觸發(fā)緊密連接結(jié)構(gòu)損傷的連鎖反應(yīng)中，TNF-α可能起到了關(guān)鍵作用。一方面可通過MLCK-MLC信號通路重塑細(xì)胞骨架微絲，導(dǎo)致緊密連接前的肌動球蛋白環(huán)收縮和緊張性增加，引起Occludin、Claudin-1、ZO-1等緊密連接蛋白及周圍細(xì)胞骨架蛋白重新分布，使得緊密連接結(jié)構(gòu)移位，細(xì)胞旁通路開放，腸黏膜通

3、透性增加;另一方面可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子產(chǎn)生，形成級聯(lián)放大效應(yīng)，加強對腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的損傷。
　　現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于修復(fù)促炎因子所致的腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷尚無行之有效的辦法。腸安Ⅱ號方是導(dǎo)師在治療肝脾不和之痛瀉名方“痛瀉要方”的基礎(chǔ)上，結(jié)合20余年的臨床經(jīng)驗優(yōu)選出的中藥復(fù)方，具有疏肝健脾、溫中止瀉之功。本課題組前期以IBS-D病證結(jié)合大鼠模型為依托，初步探討了腸安Ⅱ號方對腸黏膜免疫屏障及腸上皮細(xì)胞緊密連

4、接的影響。研究結(jié)果表明，腸安Ⅱ號方可顯著降低IBS-D病證結(jié)合大鼠血清中TNF-α、IL-1β等促炎因子的含量，降低腸黏膜通透性，同時可修復(fù)腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷，但并未對該方可能的調(diào)控機制加以深入闡釋。
　　研究目的:
　　本研究以TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷模型為依托，觀察腸安Ⅱ號方對腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用，并以MLCK-MLC信號通路及細(xì)胞因子失衡為切入點，探究腸安Ⅱ號方可能的分子調(diào)控機制。

5、　　研究方法:
　　1.Caco-2細(xì)胞在Transwell板分化21天建立腸上皮細(xì)胞緊密連接，并以TER動態(tài)變化、ALP活力、FD-4通透率及Papp、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)為觀察指標(biāo)，評價緊密連接的形成過程。利用TNF-α誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷，并觀察不同濃度TNF-α(0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)作用24h、48h、72h后TER的動態(tài)變化，以篩選TNF-α的最佳造模濃度及造模時間。

6、　　2.建立腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷模型后，將細(xì)胞分為6組:正常組（10％空白血清）、模型組（TNF-α+10％空白血清）、腸安Ⅱ號方高劑量組（TNF-α+10％高劑量含藥血清）、中劑量組（TNF-α+10％中劑量含藥血清）、低劑量組(TNF-α+10％低劑量含藥血清)及陽性藥物黃連素組（TNF-α+10％空白血清+100μM黃連素）。以24h內(nèi)TER動態(tài)變化、FD-4通透率、透射電鏡下微絨毛形態(tài)及緊密連接結(jié)構(gòu)為檢測指標(biāo)，觀察腸安Ⅱ號方對

7、腸上皮細(xì)胞緊密連接的調(diào)控作用。
　　3.以MLCK-MLC信號通路為切入點，研究腸安Ⅱ號方對腸上皮細(xì)胞緊密連接的分子調(diào)控機制:造模及分組方法同上，采用激光共聚焦顯微鏡觀察ZO-1、Claudin-1、F-actin蛋白在細(xì)胞膜的分布及NF-kBp65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移;采用Real-Time PCR檢測MLCKmRNA的表達;采用Westem-bloting檢測ZO-1、Claudin-1、Occludin及MLCK、MLC與

8、p-MLC的表達。
　　研究結(jié)果:
　　1.TNF-α誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷模型的建立與評價
　　結(jié)果提示:Caco-2細(xì)胞隨著分化時間的延長，TER值逐漸增加，分化至第21天TER達（1568.08±206.46）Ω·cm2，并維持在一個較恒定的值;細(xì)胞單層頂側(cè)與基底側(cè)ALP活力比值達（4.85±0.25）;FD-4的通透率為（2.31±1.12）％，Papp為(1.95±0.9)×10-7cm·s-1;透射電鏡

9、下顯示在細(xì)胞頂側(cè)面分化出微絨毛和完整的緊密連接結(jié)構(gòu)。
　　不同濃度TNF-α作用24h、48h、72h后，TER結(jié)果提示:正常組TER值逐漸升高，于48h末達峰，隨后緩慢下降直至72h;而TNF-α1ng/mL、10ng/mL及100ng/mL組TER均先降低后升高，于24h末降至最低。24h末TER結(jié)果提示:與正常對照組相較，TNF-α1ng/mL、10ng/mL及100 ng/mL組細(xì)胞TER值均明顯降低(p＜0.05);其中

10、TNF-α10ng/mL與100ng/mL組TER值明顯低于TNF-α1ng/mL組(p＜0.05);但該兩組TER值比較并無顯著差異(p＞0.05)。
　　2.分別從整體細(xì)胞水平及微觀細(xì)胞形態(tài)研究腸安Ⅱ號方對腸上皮細(xì)胞緊密連接的調(diào)控作用
　　(1)整體細(xì)胞水平:①TER結(jié)果提示:模型組TER持續(xù)下降，于24h降至最低。各用藥組TER值均先升高后降低，于6h達峰，此后逐漸下降，但仍高于模型組，其中以腸安Ⅱ號方高劑量組出現(xiàn)作用

11、時間最早且持續(xù)時間最長。②FD-4通透率結(jié)果提示:與正常組相較，模型組FD-4通透率顯著升高(p＜0.05);與模型組相較，各用藥組FD-4通透率均明顯降低(p＜0.05)，但用藥各組之間無明顯差異(p＞0.05)。
　　(2)微觀細(xì)胞形態(tài):透射電鏡結(jié)果提示:正常組細(xì)胞表面微絨毛分布均勻，排列整齊;緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接致密、橋粒密度較高。模型組細(xì)胞表面微絨毛減少，長短不一，分布不均且排列散亂;緊密連接結(jié)構(gòu)不完整，部分?jǐn)嗔?，連接疏

12、松，橋粒密度下降且縫隙連接明顯增寬。與模型組相較，各用藥組細(xì)胞微絨毛的形態(tài)及緊密連接結(jié)構(gòu)均得到一定修復(fù)。
　　3.基于MLCK-MLC信號通路研究腸安Ⅱ號方對腸上皮細(xì)胞緊密連接的分子調(diào)控機制
　　(1)腸安Ⅱ號方調(diào)控緊密連接蛋白在細(xì)胞膜表面的分布與表達
　　激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:正常組細(xì)胞Claudin-1、ZO-1及F-actin熒光主要沿細(xì)胞膜呈蜂巢狀線性分布，排列緊密，邊緣光滑;模型組細(xì)胞熒光強度減弱，熒光信

13、號有中斷現(xiàn)象，且Claudin-1綠色熒光信號出現(xiàn)了從細(xì)胞膜向細(xì)胞漿彌散。與模型組相較，各用藥組中斷的熒光信號均得到一定修復(fù)，其中以腸安Ⅱ號方高劑量組作用最為顯著。
　　Western-bloting結(jié)果顯示:與正常組相較，模型組中ZO-1的表達降低(p＜0.05);與模型組相較，僅有腸安Ⅱ號方高劑量組ZO-1表達上調(diào)（p＜0.05）。TNF-α對Occludin、Claudin-1的表達無明顯作用。
　　(2)腸安Ⅱ號對腸

14、上皮細(xì)胞骨架微絲的分子調(diào)控機制
　?、貼F-kBp65免疫熒光結(jié)果顯示:正常組NF-kBp65綠色熒光存在于細(xì)胞漿中，而模型組則出現(xiàn)了NF-kB p65綠色熒光由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)細(xì)胞漿和細(xì)胞核共染。與模型組相較，各用藥組的綠色熒光大部分在胞漿內(nèi)，細(xì)胞核中并未出現(xiàn)明顯的熒光染色。
　　②MLCKmRNA結(jié)果顯示:與正常組相較，模型組中MLCKmRNA表達量明顯增高(p＜0.05);與模型組相較，各用藥組MLCKmRN

15、A的表達均明顯降低(p＜0.05)，其中以黃連素組降低最為顯著（p＜0.05）。
　　③MLCK、MLC、p-MLC Western-bloting結(jié)果顯示:與正常組相較，模型組中MLCK、MLC及p-MLC的表達明顯升高（p＜0.05）。與模型組相較，腸安Ⅱ號方高、中、低劑量組及黃連素組MLCK表達均明顯降低(p＜0.05)，其中以高劑量組降低最為顯著;腸安Ⅱ號方高劑量組與黃連素組MLC表達降低(p＜0.05)，僅有腸安Ⅱ號方高

16、劑量組出現(xiàn)p-MLC表達下調(diào)(p＜0.05)。
　　4.腸安Ⅱ號方對TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞因子失衡的調(diào)控作用
　　ELISA結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組中IFN-γ、 IL-6、IL-8的含量均明顯升高(p＜0.05);與模型組相較，各用藥組中IFN-γ、IL-6、IL-8含量均明顯降低(p＜0.05)，其中在IFN-γ、IL-8上腸安Ⅱ號方呈現(xiàn)劑量依賴性，以高劑量組作用最佳。與正常組相比，模型組中IL-4、IL-10的含量

17、明顯降低（p＜0.05）;與模型組相較，僅有腸安Ⅱ號低劑量組及黃連素組IL-4含量升高（p＜0.05），IL-10的含量亦僅有黃連素組升高有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.Caco-2細(xì)胞Transwell板分化21天后可建立腸上皮細(xì)胞緊密連接，TNF-α可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞緊密連接損傷，并呈現(xiàn)時間與劑量依賴性，以30 ng/mL作用24 h為最佳造模劑量與造模時間。
　　2.腸安Ⅱ號方可改善微絨毛形