急性肝內(nèi)膽汁淤積幼鼠腸黏膜屏障損傷機(jī)制及益生菌對其干預(yù)的研究.pdf

1、第一部分
　　 急性肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸幼鼠腸黏膜屏障損傷機(jī)制的研究目的：為模擬人體淤膽型肝炎建立α-異硫氰酸萘酯(ANIT)誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸的幼鼠模型，研究急性肝內(nèi)膽汁淤積性大鼠小腸粘膜屏障的變化及其機(jī)制。
　　 方法：雄性三周齡SD大鼠ANIT50mg/kg一次性灌胃，建立急性肝內(nèi)膽汁淤積動物模型，于灌胃后24、48、72小時觀察各組大鼠血清總膽紅素（TB）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的濃度，并采用免疫組化和W

2、estern blots免疫印跡法檢測末端回腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1），閉鎖蛋白（Occludin），以及兩種細(xì)胞因子核因子-Κb （NF-Κb）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分布和表達(dá)，并利用圖像分析系統(tǒng)對Western blots圖像結(jié)果進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.灌服ANIT后，模型組大鼠血清ALT、TB逐漸升高，24h增加明顯，48h達(dá)到高峰，72h開始下降

3、。各時間點(diǎn)與對照組相比有明顯差異（P<0.01）。
　　 2.ZO-1和Occludin蛋白主要沿大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞膜的頂端呈線狀分布，模型組大鼠24h時ZO-1和Occludin的陽性染色較對照組減少，48h減少最為明顯，72h陽性染色有所恢復(fù)。Western blots結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。各時間點(diǎn)與對照組相比有明顯差異（P<0.01）。
　　 3.模型組大鼠NF-Κb和TNF-α蛋白表達(dá)與ZO-1和Occ

4、ludin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，于24h開始升高，48h達(dá)到最高點(diǎn)，72h開始有所下降。Western blots結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。各時間點(diǎn)與對照組相比有明顯差異（P<0.01）。
　　 結(jié)論：ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生時，NF-Κb受刺激激活，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)TNF-α釋放增加，TNF-α可引起其他炎癥介質(zhì)釋放增加并進(jìn)一步再活化NF-Κb，觸發(fā)炎癥介質(zhì)的“瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)”從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。由NF-Κb和TNF-α

5、介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)引起小腸黏膜上皮緊密連接蛋白分布異常及數(shù)量改變，影響腸黏膜上皮屏障的完整性，破壞小腸黏膜屏障。急性肝內(nèi)膽汁淤積；緊密連接蛋白；腸黏膜屏障；核轉(zhuǎn)錄因子；炎癥介質(zhì)第二部分益生菌對急性肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸幼鼠腸粘膜屏障影響目的：研究雙歧三聯(lián)活菌（培菲康）對急性肝內(nèi)膽汁淤積性大鼠小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的影響以及對細(xì)胞因子NF-Κb和TNF-α表達(dá)的影響，從而探討益生菌制劑對急性肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸幼鼠腸

6、粘膜屏障的保護(hù)機(jī)制，為益生菌制劑在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：雄性三周齡SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和培菲康組，模型組和培菲康組均給予ANIT50mg/kg一次性灌胃，建立急性肝內(nèi)膽汁淤積動物模型，培菲康組于造模前4天開始給予培菲康4.2×108個活菌數(shù)/kg/d灌胃大鼠。分別于造模后24、48、72小時三個時間點(diǎn)處死大鼠，取腹主動脈血檢測血清TB和ALT水平，并取末端回腸黏膜組織，采用免疫組化和Western b

7、lots免疫印跡法檢測緊密連接蛋白ZO-1， Occludin，以及細(xì)胞因子NF-Κb和TNF-α的分布和表達(dá)，并利用圖像分析系統(tǒng)對Western blots圖像結(jié)果進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.各時間點(diǎn)培菲康組大鼠血清ALT、TB較模型組明顯降低（P<0.05）。
　　 2.模型組大鼠24h時ZO-1和Occludin的陽性染色較對照組減少，48h減少最為明顯，72h陽性染色有所恢復(fù)，而培菲康組大鼠各

8、時間點(diǎn)ZO-1和Occludin的陽性染色和模型組相比均明顯增多。Western blots結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致，模型組24h已經(jīng)開始下降，48h達(dá)到最低，72h開始恢復(fù)，各時間點(diǎn)與對照組相比有明顯差異（P<0.01）；而培菲康組各時間點(diǎn)蛋白表達(dá)與模型組相應(yīng)時間點(diǎn)數(shù)據(jù)相比有明顯恢復(fù)（P<0.05）。
　　 3.模型組大鼠NF-Κb和TNF-α蛋白表達(dá)較對照組于24h開始升高，48h達(dá)到最高點(diǎn)，72h開始有所下降。West

9、ern blots結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致。各時間點(diǎn)與對照組相比有明顯差異（P<0.01）。培菲康組大鼠NF-Κb和TNF-α的蛋白表達(dá)與模型組大鼠在各時間點(diǎn)相比均明顯降低（P<0.05）。
　　 結(jié)論：雙歧三聯(lián)活菌能夠增加急性肝內(nèi)膽汁淤積性黃疸大鼠小腸黏膜上皮緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)，同時能降低NF-Κb和TNF-α兩種細(xì)胞因子在腸道內(nèi)的表達(dá)，從而降低腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生的幾率，有助于恢復(fù)腸黏膜上皮屏障的