TLR4-NF-κB通路介導(dǎo)軟脂酸誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生炎癥的分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：軟脂酸對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　目的:①探討軟脂酸對(duì)HA-VSMC炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1表達(dá)的影響;②探討不同信號(hào)通路阻斷劑對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)HA-VSMC炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1表達(dá)的影響。
　　方法:采用不同劑量的軟脂酸處理細(xì)胞6h、12h、24h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)對(duì)照組(含2％BSA),LPS(10ng/ml)作用24h作為陽(yáng)性對(duì)照;提取細(xì)胞RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢

2、測(cè)IL-8、IL-6和MCP-1mRNA的表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)IL-8、IL-6和MCP-1的蛋白表達(dá)水平。分別加入PKC、磷脂酰肌醇3激酶、神經(jīng)酰胺、NF-κB和MAPK抑制劑培養(yǎng)30min,再加入軟脂酸培養(yǎng)6h,同時(shí)設(shè)相應(yīng)的對(duì)照組(含1/1000二甲基亞砜和2%BSA)。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-8、IL-6和MCP-1 mRNA的表達(dá)水平;ELISA檢測(cè)IL-8、IL-6和MCP-1的蛋白表

3、達(dá)水平。
　　結(jié)果:軟脂酸顯著促進(jìn)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)且具有時(shí)間效應(yīng)和劑量依賴(lài)關(guān)系。NF-κB阻斷劑parthenolide顯著抑制軟脂酸誘導(dǎo)HA-VSMCIL-8 mRNA和蛋白表達(dá),PKC阻斷劑calphostin C和白屈菜紅堿部分抑制軟脂酸誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞IL-8mRNA和蛋白水平的表達(dá),myriocin和wortmannin對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)無(wú)明顯

4、作用。parthenolide和PKC阻斷劑白屈菜紅堿下調(diào)軟脂酸誘導(dǎo)的IL-6 mRNA和蛋白表達(dá),而MAPK阻斷劑PD98059和PI3K抑制劑wortmannin對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的IL-6mRNA和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯作用;parthenolide顯著抑制軟脂酸誘導(dǎo)HA-VSMCMCP-1 mRNA和蛋白表達(dá),而白屈菜紅堿、wortmannin和神經(jīng)酰胺抑制劑myriocin對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯作用。

5、　　結(jié)論:①軟脂酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞IL-8、IL-6和MCP-1等炎癥因子表達(dá),導(dǎo)致HVASMC產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。②NF-κB和PKC通路介導(dǎo)了軟脂酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞IL-8、IL-6基因的表達(dá),軟脂酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞MCP-1基因的表達(dá)是由NF-κB通路介導(dǎo)。
　　第二部分：TLR-4/NF-κB通路在軟脂酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)中的作用
　　目的:探討TLR-4/NF-κB信號(hào)在軟脂酸調(diào)控HAVSMC炎

6、癥因子表達(dá)中的作用。
　　方法:構(gòu)建TLR4shRNA腺病毒載體,采用pGSadeno-TLR4感染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HA-VSMC,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TLR4mRNA的表達(dá)水平,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)水平,觀察軟脂酸誘導(dǎo)的HVASMCIL-8、IL-6和MCP-1mRNA和蛋白水平的表達(dá)。采用軟脂酸干預(yù)細(xì)胞6h,提取細(xì)胞核蛋白,采用ELISA測(cè)定NF-Κbp65亞基的結(jié)合活性。