TLR4-NF-κB通路介導軟脂酸誘導血管平滑肌細胞產(chǎn)生炎癥的分子機制研究.pdf

1、第一部分：軟脂酸對人血管平滑肌細胞炎癥因子表達的調(diào)節(jié)作用
　　目的:①探討軟脂酸對HA-VSMC炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1表達的影響;②探討不同信號通路阻斷劑對軟脂酸誘導HA-VSMC炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1表達的影響。
　　方法:采用不同劑量的軟脂酸處理細胞6h、12h、24h,每個時間點設對照組(含2％BSA),LPS(10ng/ml)作用24h作為陽性對照;提取細胞RNA,實時熒光定量PCR檢

2、測IL-8、IL-6和MCP-1mRNA的表達水平;ELISA檢測IL-8、IL-6和MCP-1的蛋白表達水平。分別加入PKC、磷脂酰肌醇3激酶、神經(jīng)酰胺、NF-κB和MAPK抑制劑培養(yǎng)30min,再加入軟脂酸培養(yǎng)6h,同時設相應的對照組(含1/1000二甲基亞砜和2%BSA)。在相應的時間點收獲細胞和培養(yǎng)上清,實時熒光定量PCR檢測IL-8、IL-6和MCP-1 mRNA的表達水平;ELISA檢測IL-8、IL-6和MCP-1的蛋白表

3、達水平。
　　結(jié)果:軟脂酸顯著促進人主動脈血管平滑肌細胞炎癥因子IL-8、IL-6和MCP-1 mRNA和蛋白表達且具有時間效應和劑量依賴關系。NF-κB阻斷劑parthenolide顯著抑制軟脂酸誘導HA-VSMCIL-8 mRNA和蛋白表達,PKC阻斷劑calphostin C和白屈菜紅堿部分抑制軟脂酸誘導的人血管平滑肌細胞IL-8mRNA和蛋白水平的表達,myriocin和wortmannin對軟脂酸誘導的IL-8表達無明顯

4、作用。parthenolide和PKC阻斷劑白屈菜紅堿下調(diào)軟脂酸誘導的IL-6 mRNA和蛋白表達,而MAPK阻斷劑PD98059和PI3K抑制劑wortmannin對軟脂酸誘導的IL-6mRNA和蛋白表達均無明顯作用;parthenolide顯著抑制軟脂酸誘導HA-VSMCMCP-1 mRNA和蛋白表達,而白屈菜紅堿、wortmannin和神經(jīng)酰胺抑制劑myriocin對軟脂酸誘導MCP-1 mRNA和蛋白的表達均無明顯作用。

5、　　結(jié)論:①軟脂酸誘導人血管平滑肌細胞IL-8、IL-6和MCP-1等炎癥因子表達,導致HVASMC產(chǎn)生炎癥反應。②NF-κB和PKC通路介導了軟脂酸誘導人血管平滑肌細胞IL-8、IL-6基因的表達,軟脂酸誘導人血管平滑肌細胞MCP-1基因的表達是由NF-κB通路介導。
　　第二部分：TLR-4/NF-κB通路在軟脂酸誘導人血管平滑肌細胞炎癥因子表達中的作用
　　目的:探討TLR-4/NF-κB信號在軟脂酸調(diào)控HAVSMC炎

6、癥因子表達中的作用。
　　方法:構(gòu)建TLR4shRNA腺病毒載體,采用pGSadeno-TLR4感染生長狀態(tài)良好的HA-VSMC,采用實時熒光定量PCR檢測TLR4mRNA的表達水平,Western blotting檢測細胞TLR4蛋白的表達水平,觀察軟脂酸誘導的HVASMCIL-8、IL-6和MCP-1mRNA和蛋白水平的表達。采用軟脂酸干預細胞6h,提取細胞核蛋白,采用ELISA測定NF-Κbp65亞基的結(jié)合活性。