PPARγ介導的抗氧化機制在血管平滑肌細胞表型轉化中作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　越來越多的證據(jù)表明，血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖、遷移是許多血管性疾病的病理生理基礎，這些疾病包括動脈粥樣硬化，血管成形術后再狹窄等。在正常、健康的血管中，VSMC存在于血管壁的中間層，并處于靜息狀態(tài)。當有導致動脈粥樣硬化的因素出現(xiàn)時，VSMC受刺激后發(fā)生表型轉化，由中膜增殖、遷移至血管內膜，最終導致血管內膜增生，管腔狹窄。動物研究結果表明抑制VSMC增殖、

2、遷移可以有效的減少血管新生內膜的形成。
　　活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量產生并且積聚是引起機體氧化應激(Oxidative stress)的主要原因。大量研究證實氧化應激是促使VSMC發(fā)生表型轉化的重要始動因素。我們課題組以前的研究也證實減少ROS的產生能夠抑制VSMC向促炎及促增殖表型轉化。因此，減輕氧化應激是抑制VSMC的表型轉化的有效措施。近期有學者研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖激活受體γ(

3、Peroxisome Proliferator-ActivatedReceptorγ，PPARγ)活化后能夠減輕小鼠延髓頭端腹外側區(qū)的氧化應激，進而起到降低血壓的作用。此外，我們以前的研究也表明活化的PPARγ能夠抑制VSMC的表型轉化，減輕損傷血管的內膜增生。然而，目前為止活化的PPARγ是否能夠通過減輕氧化應激來抑制VSMC增殖、遷移還不是很清楚。
　　線粒體是真核細胞有氧呼吸的場所，是細胞能量代謝工廠，因而也就成為ROS的主

4、要來源。線粒體解偶聯(lián)蛋白(Mitochondrial uncoupling proteins，UCPs)是目前研究發(fā)現(xiàn)的主要的抗氧化劑，通過維持線粒體ROS的平衡減輕氧化應激反應，保護組織和細胞免于氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)UCPs家族中成員之一的UCP2抗氧化應激的作用非常重要，而且PPARγ能夠通過上調UCP2減輕組織的氧化損傷。我們推測PPARγ活化后能夠通過上調VSMC中UCP2的表達減輕細胞的氧化應激，抑制增殖和遷移，進而減輕因VSM

5、C增殖、遷移引起的血管內膜增生。
　　為了驗證我們的假設，將實驗分成三個部分:第一部分討論PPARγ對VSMC表型轉化和氧化應激的作用。用PDGF-BB誘導原代培養(yǎng)的VSMC增殖、遷移并觀察氧化應激對VSMC增殖、遷移的作用。用PPARγ特異性配體羅格列酮(Rosiglitazone，RSG)活化VSMC中的PPARγ，用抑制劑GW9662抑制PPARγ，觀察PPARγ活化或抑制后VCMC中ROS的產生，以及細胞增殖和遷移的情況。

6、同時應用Western blot檢測各組VSMC中增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)的表達水平。第二部分探討PPARγ活化后是否是通過上調UCP2的表達來抑制VSMC的增殖和遷移的。分別用RSG和GW9662來活化和抑制VSMC中PPARγ，觀察PPARγ活化或抑制后VSMC中UCP2的表達，以

7、明確激活的PPARγ是否能夠上調VSMC中的UCP2的表達。然后進一步探討激活PPARγ后是否是通過對VSMC中UCP2的調控來減輕細胞氧化應激，抑制細胞增殖和遷移的。第三部分在體研究PPARγ活化后是否是通過上調UCP2的表達抑制頸動脈的內膜增生。用非顯微外科頸動脈損傷法制備野生型小鼠和UCP2-/-小鼠頸動脈損傷的模型，觀察口服RSG對小鼠體內的UCP2的表達的作用及野生型小鼠和UCP2-/-小鼠頸動脈損傷并給藥后血管組織ROS產生

8、的情況。進一步探討野生型小鼠和UCP2-/-小鼠損傷頸動脈血管內膜增生的情況，以明確UCP2在PPARγ活化后減輕小鼠頸動脈內膜增生中的作用。
　　方法:
　　本論文分為離體實驗和在體實驗兩部分，離體實驗使用的VSMC來源于C57BL/6J背景野生型(WT)小鼠和UCP2基因敲除(UCP2-/-)小鼠胸主動脈組織的原代培養(yǎng);應用C57BL/6J背景的WT小鼠和UCP2-/-小鼠進行在體實驗。
　　1.利用組織貼塊法原代

9、培養(yǎng)VSMC。
　　2.用PDGF-BB誘導VSMC增殖、遷移。
　　3.非顯微外科頸動脈線損傷法用于制備小鼠頸動脈內膜增生的模型。
　　4.應用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察小鼠頸動脈內膜增生的情況。
　　6.原代培養(yǎng)的VSMC用α-SMA免疫熒光進行檢測。
　　7.應用PPARγ配體RSG和PPARγ抑制劑GW9662分別上調和下調離體VSMC中PPARγ表達。
　　8.應用二氫乙錠(DHE)來檢

10、測VSMC和組織樣本的ROS的產生。
　　9.蛋白免疫印跡用于檢測UCP2和PPARγ的表達，應用免疫熒光觀察培養(yǎng)的VSMC中的UCP2的表達。
　　10.MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物）細胞增殖分析法用于檢測VSMC增殖能力，Transwell法檢測VSMC的遷移能力。
　　結果：
　　1.ROS引起VSMC增殖和遷移用濃度為20μg/L的PDGF-BB刺激原代

11、培養(yǎng)的VSMC發(fā)現(xiàn)增殖和遷移能力明顯加強，ROS的產生明顯增加。給予ROS清除劑NAC后ROS的產生及細胞增殖、遷移能力則出現(xiàn)顯著下降。
　　2.RSG呈時間依賴性上調VSMC中的PPARγPPARγ特異性配體RSG(10μmol/L)刺激VSMC后，用Western blot觀察到細胞中的PPARγ表達呈時間依賴性的上調。在6h后出現(xiàn)明顯增加，12h后表達量達到最高值，并且持續(xù)至24h。
　　3.PPARγ抑制VSMC增殖

12、和遷移分別用PPARγ激動劑RSG和抑制劑GW9662檢測PPARγ對PDGF-BB誘導的VSMC中ROS產生的影響，結果顯示PDGF-BB能夠增加VSMC中ROS的產生，當給予RSG激活PPARγ后ROS的產生下降，應用GW9662抑制PPARγ后ROS產生又出現(xiàn)顯著增加，且活化的PPARγ能夠抑制PDGF-BB誘導的VSMC的增殖和遷移。此外，PPARγ活化后能夠顯著減少VSMC中PCNA及MMP9的表達，而抑制PPARγ后VSMC

13、中這兩種蛋白表達量增加。
　　4.PPARγ通過上調VSMC中的UCP2抑制細胞增殖和遷移特異性配體RSG活化的PPARγ能夠呈時間依賴性的上調VSMC中UCP2的表達，作用6h時VSMC中UCP2的表達開始升高，12h時表達達到最高值。且PPARγ抑制劑GW9662能夠顯著抑制VSMC中UCP2的表達。應用WT VSMC和UCP2-/-VSMC探討UCP2對VSMC氧化應激的影響的結果顯示，PDGF-BB明顯增加WT VSMC中

14、ROS的產生，而給予RSG活化PPARγ后ROS的產生顯著下降。UCP2-/-VSMC給予RSG后ROS的產生仍明顯高于WT VSMC。對UCP2在VSMC增殖和遷移中的作用的研究顯示，PDGF-BB明顯加強WT VSMC的增殖和遷移能力，激活PPARγ后VSMC的增殖和遷移能力明顯受到抑制。而UCP2-/-VSMC給予RSG活化PPARγ后細胞的增殖和遷移能力仍明顯高于WT VSMC。
　　5.PPARγ通過上調UCP2抑制損傷

15、頸動脈的氧化應激小鼠頸動脈損傷模型構建后給予RSG10mg/kg胃內灌注，2周后取頸動脈組織Western Blot方法觀察組織中UCP2的表達。結果顯示，RSG明顯上調野生型小鼠頸動脈組織中UCP2的表達，而RSG對UCP2-/-小鼠頸動脈組織中的UCP2表達沒有調節(jié)作用。給予RSG口服后激活PPARγ能夠抑制野生型小鼠損傷的頸動脈ROS產生，RSG對UCP2-/-小鼠損傷血管的ROS產生沒有明顯下調作用。
　　6.PPARγ通

16、過上調UCP2減輕損傷頸動脈的內膜增生用常規(guī)HE染色觀察野生型小鼠和UCP2-/-小鼠損傷血管形態(tài)學變化。用內膜與中膜的比值來計算血管內膜增生的程度。結果顯示，野生型小鼠損傷的頸動脈內膜與中膜的比值較假手術組相比明顯上升，給予RSG口服后能夠明顯降低損傷血管內膜增生。而RSG對UCP2-/-小鼠損傷血管內膜增生沒有明顯改善作用。
　　結論:
　　本研究證實PDGF-BB誘導的VSMC增殖和遷移是受PPARγ調控的;PPARγ