PPARγ介導(dǎo)的抗氧化機(jī)制在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　越來越多的證據(jù)表明，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖、遷移是許多血管性疾病的病理生理基礎(chǔ)，這些疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化，血管成形術(shù)后再狹窄等。在正常、健康的血管中，VSMC存在于血管壁的中間層，并處于靜息狀態(tài)。當(dāng)有導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的因素出現(xiàn)時(shí)，VSMC受刺激后發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，由中膜增殖、遷移至血管內(nèi)膜，最終導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生，管腔狹窄。動(dòng)物研究結(jié)果表明抑制VSMC增殖、

2、遷移可以有效的減少血管新生內(nèi)膜的形成。
　　活性氧(Reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生并且積聚是引起機(jī)體氧化應(yīng)激(Oxidative stress)的主要原因。大量研究證實(shí)氧化應(yīng)激是促使VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要始動(dòng)因素。我們課題組以前的研究也證實(shí)減少ROS的產(chǎn)生能夠抑制VSMC向促炎及促增殖表型轉(zhuǎn)化。因此，減輕氧化應(yīng)激是抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化的有效措施。近期有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖激活受體γ(

3、Peroxisome Proliferator-ActivatedReceptorγ，PPARγ)活化后能夠減輕小鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)的氧化應(yīng)激，進(jìn)而起到降低血壓的作用。此外，我們以前的研究也表明活化的PPARγ能夠抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化，減輕損傷血管的內(nèi)膜增生。然而，目前為止活化的PPARγ是否能夠通過減輕氧化應(yīng)激來抑制VSMC增殖、遷移還不是很清楚。
　　線粒體是真核細(xì)胞有氧呼吸的場(chǎng)所，是細(xì)胞能量代謝工廠，因而也就成為ROS的主

4、要來源。線粒體解偶聯(lián)蛋白(Mitochondrial uncoupling proteins，UCPs)是目前研究發(fā)現(xiàn)的主要的抗氧化劑，通過維持線粒體ROS的平衡減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)組織和細(xì)胞免于氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)UCPs家族中成員之一的UCP2抗氧化應(yīng)激的作用非常重要，而且PPARγ能夠通過上調(diào)UCP2減輕組織的氧化損傷。我們推測(cè)PPARγ活化后能夠通過上調(diào)VSMC中UCP2的表達(dá)減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激，抑制增殖和遷移，進(jìn)而減輕因VSM

5、C增殖、遷移引起的血管內(nèi)膜增生。
　　為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，將實(shí)驗(yàn)分成三個(gè)部分:第一部分討論P(yáng)PARγ對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)化和氧化應(yīng)激的作用。用PDGF-BB誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的VSMC增殖、遷移并觀察氧化應(yīng)激對(duì)VSMC增殖、遷移的作用。用PPARγ特異性配體羅格列酮(Rosiglitazone，RSG)活化VSMC中的PPARγ，用抑制劑GW9662抑制PPARγ，觀察PPARγ活化或抑制后VCMC中ROS的產(chǎn)生，以及細(xì)胞增殖和遷移的情況。

6、同時(shí)應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組VSMC中增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)的表達(dá)水平。第二部分探討PPARγ活化后是否是通過上調(diào)UCP2的表達(dá)來抑制VSMC的增殖和遷移的。分別用RSG和GW9662來活化和抑制VSMC中PPARγ，觀察PPARγ活化或抑制后VSMC中UCP2的表達(dá)，以

7、明確激活的PPARγ是否能夠上調(diào)VSMC中的UCP2的表達(dá)。然后進(jìn)一步探討激活PPARγ后是否是通過對(duì)VSMC中UCP2的調(diào)控來減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞增殖和遷移的。第三部分在體研究PPARγ活化后是否是通過上調(diào)UCP2的表達(dá)抑制頸動(dòng)脈的內(nèi)膜增生。用非顯微外科頸動(dòng)脈損傷法制備野生型小鼠和UCP2-/-小鼠頸動(dòng)脈損傷的模型，觀察口服RSG對(duì)小鼠體內(nèi)的UCP2的表達(dá)的作用及野生型小鼠和UCP2-/-小鼠頸動(dòng)脈損傷并給藥后血管組織ROS產(chǎn)生

8、的情況。進(jìn)一步探討野生型小鼠和UCP2-/-小鼠損傷頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生的情況，以明確UCP2在PPARγ活化后減輕小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生中的作用。
　　方法:
　　本論文分為離體實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)兩部分，離體實(shí)驗(yàn)使用的VSMC來源于C57BL/6J背景野生型(WT)小鼠和UCP2基因敲除(UCP2-/-)小鼠胸主動(dòng)脈組織的原代培養(yǎng);應(yīng)用C57BL/6J背景的WT小鼠和UCP2-/-小鼠進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)。
　　1.利用組織貼塊法原代

9、培養(yǎng)VSMC。
　　2.用PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC增殖、遷移。
　　3.非顯微外科頸動(dòng)脈線損傷法用于制備小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生的模型。
　　4.應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生的情況。
　　6.原代培養(yǎng)的VSMC用α-SMA免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)。
　　7.應(yīng)用PPARγ配體RSG和PPARγ抑制劑GW9662分別上調(diào)和下調(diào)離體VSMC中PPARγ表達(dá)。
　　8.應(yīng)用二氫乙錠(DHE)來檢

10、測(cè)VSMC和組織樣本的ROS的產(chǎn)生。
　　9.蛋白免疫印跡用于檢測(cè)UCP2和PPARγ的表達(dá)，應(yīng)用免疫熒光觀察培養(yǎng)的VSMC中的UCP2的表達(dá)。
　　10.MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑鎓溴化物）細(xì)胞增殖分析法用于檢測(cè)VSMC增殖能力，Transwell法檢測(cè)VSMC的遷移能力。
　　結(jié)果：
　　1.ROS引起VSMC增殖和遷移用濃度為20μg/L的PDGF-BB刺激原代

11、培養(yǎng)的VSMC發(fā)現(xiàn)增殖和遷移能力明顯加強(qiáng)，ROS的產(chǎn)生明顯增加。給予ROS清除劑NAC后ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞增殖、遷移能力則出現(xiàn)顯著下降。
　　2.RSG呈時(shí)間依賴性上調(diào)VSMC中的PPARγPPARγ特異性配體RSG(10μmol/L)刺激VSMC后，用Western blot觀察到細(xì)胞中的PPARγ表達(dá)呈時(shí)間依賴性的上調(diào)。在6h后出現(xiàn)明顯增加，12h后表達(dá)量達(dá)到最高值，并且持續(xù)至24h。
　　3.PPARγ抑制VSMC增殖

12、和遷移分別用PPARγ激動(dòng)劑RSG和抑制劑GW9662檢測(cè)PPARγ對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC中ROS產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示PDGF-BB能夠增加VSMC中ROS的產(chǎn)生，當(dāng)給予RSG激活PPARγ后ROS的產(chǎn)生下降，應(yīng)用GW9662抑制PPARγ后ROS產(chǎn)生又出現(xiàn)顯著增加，且活化的PPARγ能夠抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC的增殖和遷移。此外，PPARγ活化后能夠顯著減少VSMC中PCNA及MMP9的表達(dá)，而抑制PPARγ后VSMC

13、中這兩種蛋白表達(dá)量增加。
　　4.PPARγ通過上調(diào)VSMC中的UCP2抑制細(xì)胞增殖和遷移特異性配體RSG活化的PPARγ能夠呈時(shí)間依賴性的上調(diào)VSMC中UCP2的表達(dá)，作用6h時(shí)VSMC中UCP2的表達(dá)開始升高，12h時(shí)表達(dá)達(dá)到最高值。且PPARγ抑制劑GW9662能夠顯著抑制VSMC中UCP2的表達(dá)。應(yīng)用WT VSMC和UCP2-/-VSMC探討UCP2對(duì)VSMC氧化應(yīng)激的影響的結(jié)果顯示，PDGF-BB明顯增加WT VSMC中

14、ROS的產(chǎn)生，而給予RSG活化PPARγ后ROS的產(chǎn)生顯著下降。UCP2-/-VSMC給予RSG后ROS的產(chǎn)生仍明顯高于WT VSMC。對(duì)UCP2在VSMC增殖和遷移中的作用的研究顯示，PDGF-BB明顯加強(qiáng)WT VSMC的增殖和遷移能力，激活PPARγ后VSMC的增殖和遷移能力明顯受到抑制。而UCP2-/-VSMC給予RSG活化PPARγ后細(xì)胞的增殖和遷移能力仍明顯高于WT VSMC。
　　5.PPARγ通過上調(diào)UCP2抑制損傷

15、頸動(dòng)脈的氧化應(yīng)激小鼠頸動(dòng)脈損傷模型構(gòu)建后給予RSG10mg/kg胃內(nèi)灌注，2周后取頸動(dòng)脈組織Western Blot方法觀察組織中UCP2的表達(dá)。結(jié)果顯示，RSG明顯上調(diào)野生型小鼠頸動(dòng)脈組織中UCP2的表達(dá)，而RSG對(duì)UCP2-/-小鼠頸動(dòng)脈組織中的UCP2表達(dá)沒有調(diào)節(jié)作用。給予RSG口服后激活PPARγ能夠抑制野生型小鼠損傷的頸動(dòng)脈ROS產(chǎn)生，RSG對(duì)UCP2-/-小鼠損傷血管的ROS產(chǎn)生沒有明顯下調(diào)作用。
　　6.PPARγ通

16、過上調(diào)UCP2減輕損傷頸動(dòng)脈的內(nèi)膜增生用常規(guī)HE染色觀察野生型小鼠和UCP2-/-小鼠損傷血管形態(tài)學(xué)變化。用內(nèi)膜與中膜的比值來計(jì)算血管內(nèi)膜增生的程度。結(jié)果顯示，野生型小鼠損傷的頸動(dòng)脈內(nèi)膜與中膜的比值較假手術(shù)組相比明顯上升，給予RSG口服后能夠明顯降低損傷血管內(nèi)膜增生。而RSG對(duì)UCP2-/-小鼠損傷血管內(nèi)膜增生沒有明顯改善作用。
　　結(jié)論:
　　本研究證實(shí)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移是受PPARγ調(diào)控的;PPARγ