SOCS1介導(dǎo)AngⅡ促血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子-1（suppressor of cytokine signal1ing-1,SOCS1）對血管緊張素II（AngiotensinⅡ,AngⅡ）誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖的影響及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1）以人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）為研究對象，建立AngⅡ促VSMC增殖模型。用0mol/L、10-

2、8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L等不同終濃度的AngⅡ孵育細(xì)胞48h，行MTT檢測，得出作用最明顯的濃度，以該濃度AngⅡ孵育細(xì)胞0h、12h、24h、48h、72h，行MTT檢測，得出最佳作用時(shí)間。
　　2）最佳作用濃度AngⅡ分別刺激VSMC0h、12h、24h、48h、72h，DCFH-DA探針檢測活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平，Western-b

3、lot檢測SOCS1表達(dá)情況。
　　3）設(shè)計(jì)與合成3對靶向人SOCS1基因的siRNA(SOCS1-siRNA)，實(shí)時(shí)熒光定量-PCR和Western-blot篩選最佳SOCS1-siRNA。
　　4）用陽離子脂質(zhì)體將最佳SOCS1-siRNA轉(zhuǎn)染VSMC，給予AngⅡ孵育。實(shí)驗(yàn)作2個(gè)分組：
　　實(shí)驗(yàn)1：空白對照組、SOCS1-siRNA組、AngⅡ組、AngⅡ+SOCS1-siRNA組、Ly294002組、Ly294

4、002+AngⅡ組；（Ly294002為Akt信號通路阻斷劑）
　　實(shí)驗(yàn)2：空白對照組、SOCS1-siRNA組、天然維生素E組、AngⅡ組、AngⅡ+SOCS1-siRNA組、、天然維生素E+AngⅡ組。(天然維生素E為ROS清除劑)
　　5）用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，DCFH-DA探針法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，Western-blot技術(shù)分別測定SOCS1、凋亡相關(guān)基因Bax和Bc

5、l-2、Akt信號通路蛋白總Akt、p-Akt的表達(dá)。
　　6）數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1）10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的AngⅡ均可促進(jìn)VSMC增殖，其中10-7mol/L濃度的AngⅡ作用最明顯；用10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC0h、12h、24h、48h、72h

6、，其促增殖的作用在48h內(nèi)表現(xiàn)為時(shí)間依賴性，刺激72h時(shí)的其促增殖作用與48h無明顯差異。選取10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC48h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2） AngⅡ促進(jìn)VSMC內(nèi)ROS生成及SOCS1表達(dá)。
　　3）成功設(shè)計(jì)并篩選出一對能夠有效沉默SOCS1表達(dá)的SOCS1-siRNA3。
　　4）與空白對照組相比，AngⅡ組細(xì)胞增殖率明顯增加（P<0.01），SOCS1-siRNA、Ly294002組VSM

7、C增殖率下降（P<0.01），凋亡率明顯上升（P<0.05）；SOCS1-siRNA、Ly294002對VSMC生存的影響效果相似（P>0.05）；SOCS1-siRNA+AngⅡ組、Ly294002+AngⅡ組細(xì)胞增殖率與AngⅡ組相比明顯下降（P<0.01），凋亡率與空白對照組相比無明顯差異（P>0.05），兩者之間的存活率相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　5）與空白對照組相比，SOCS1-siRNA組的SOCS1蛋白

8、的表達(dá)明顯降低（P<0.01）、Bax/Bcl2比值增大（P<0.01），AngⅡ組Bax/Bcl2比值減小（P<0.05）；與AngⅡ組相比，SOCS1-siRNA+AngⅡ組的SOCS1蛋白表達(dá)減少（P<0.01）、Bax/Bcl2比值增大（P<0.01）；與空白對照組相比，Ly294002組SOCS1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而Bax/Bcl2比值增大（P<0.01）；與Ly294002組相比，Ly294002+A

9、ngⅡ組的Bax/Bcl2比值明顯減?。≒<0.01）。
　　6）各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的總Akt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與空白對照組相比，AngⅡ組p-Akt蛋白表達(dá)增加（P<0.05）、SOCS1-siRNA組、Ly294002組p-Akt表達(dá)明顯下降（P<0.01），并且后兩者p-Akt蛋白無明顯差異（P>0.05）；與AngⅡ組相比，SOCS1-siRNA+AngⅡ組、Ly294002+AngⅡ組p-Akt表達(dá)減少（

10、p<0.05），且這兩組相互之間的p-Akt蛋白的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　7）與空白對照組相比，SOCS1-siRNA組平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity,MFI）減低（P<0.05）、細(xì)胞增殖率下降（P<0.05）、凋亡率上升（P<0.01），AngⅡ組MFI明顯增強(qiáng)（P<0.01）、增殖率明顯增加（P<0.01），凋亡率無明顯變化（P>0.05），天然維生素E組MFI、增殖率、

11、凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與AngⅡ組相比，SOCS1-siRNA+AngⅡ組、天然維生素E+AngⅡ組的MFI明顯降低（P<0.01），增殖率下降（P<0.01），凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）RNA干擾可以有效的抑制SOCS1在臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2）SOCS1表達(dá)下調(diào)可以有效地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，SOCS1介導(dǎo)了AngⅡ促血管平滑肌細(xì)