NADPH氧化酶調(diào)節(jié)TLR4介導的血管平滑肌細胞增殖和炎癥表型的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　心腦血管疾病嚴重危害著人類的身體健康,動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)作為其中最常見的一種血管病變,已成為基礎和臨床研究的焦點。AS被認為是一種慢性炎癥性疾病,伴有免疫反應的炎癥過程貫穿于其發(fā)生和發(fā)展的始終。而AS內(nèi)膜增生的形成與血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)的過度增殖并從中膜遷移到內(nèi)膜密切相關。在參與調(diào)節(jié)AS的諸多分子中,Toll樣受體4

2、(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種與免疫性和炎癥性疾病密切相關的模式識別受體,其介導的炎癥反應在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。當血管受到損傷時,位于血管中膜層的VSMC活化,并在TLR4的作用下大量增殖遷移至內(nèi)膜下,分泌多種炎癥因子(如IL-1、IL-6、IFN、MCP-1、TNF-α等),導致血管炎癥反應和動脈內(nèi)膜增生,最終促進AS的形成。
　　活性氧(reactive oxygen species,

3、ROS)是調(diào)節(jié)血管結構和功能狀態(tài)的重要信號分子,ROS的蓄積可誘導炎癥因子的表達,促進AS的發(fā)生和發(fā)展。目前,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶被認為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體,是維持血管細胞氧化還原狀態(tài)的一個重要決定因素。NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS可作為第二信使,激活細胞內(nèi)的信號轉導通路,參與動脈內(nèi)膜增生和血管炎癥反應,進而影響

4、AS的發(fā)生和發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶在TLR4的表達和活化中發(fā)揮著重要作用,但NADPH氧化酶是否通過TLR4參與調(diào)節(jié)VSMC的增殖遷移以及炎癥反應,進而促進動脈內(nèi)膜增生和AS的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。
　　有基于此,本研究擬深入探討TLR4介導的VSMC增殖遷移和炎癥表型在AS中的重要作用,以NADPH氧化酶為切入點,分別采用NADPH氧化酶激動劑血小板源性生長因子BB(Platelet-derived growth

5、factor-BB,PDGF-BB)和抑制劑夾竹桃麻素(apocynin)使NADPH氧化酶過表達和表達抑制,探討NADPH氧化酶在TLR4介導的VSMC增殖遷移、炎癥反應和動脈內(nèi)膜增生中的作用,為深入研究AS形成的機制提供新思路,為尋找防治AS的新靶點提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　在體動物實驗部分:采用非顯微外科手術方法,建立wire誘導的小鼠頸動脈損傷模型。根據(jù)實驗動物來源及干預措施的不同,分別分為:C57BL/

6、6J小鼠:①假手術組,②手術組(手術損傷左側頸總動脈),③手術+NADPH氧化酶抑制劑組(手術+apocynin灌胃200mg/kg.d);TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠:①假手術組,②手術組(手術損傷左側頸總動脈),③手術+NADPH氧化酶抑制劑組(手術+apocynin灌胃200mg/kg.d)。在小鼠頸動脈損傷后14天,分別取各組小鼠損傷側頸總動脈,采用HE染色方法在顯微鏡下觀察新生內(nèi)膜增生情況并計算內(nèi)膜/中膜的比值;采用

7、Western blot方法檢測損傷動脈TLR4蛋白的表達情況。在小鼠頸動脈損傷后14天,分別采集各組小鼠外周血液,采用ELISA方法測定炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。
　　離體細胞實驗部分:采用組織貼塊法培養(yǎng)C57和TLR4-/-小鼠胸主動脈VSMCs,倒置相差顯微鏡下觀察C57及TLR4-/-VSMCs生長形態(tài),并通過α-SMA免疫熒光染色鑒定所培養(yǎng)的VSMCs,選取生長良好的3-6代細胞進行實驗。根據(jù)細

8、胞來源及干預措施的不同分為:C57-VSMCs:①對照組(加入等體積的PBS溶液);②PDGF-BB處理組(加20ug/LPDGF-BB,37℃5％CO2培養(yǎng)24h);③Apocynin處理組(加100umol/Lapocynin預處理1h后再加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培養(yǎng)24h)。TLR4-/--VSMCs:①對照組(加入等體積的PBS溶液);②PDGF-BB處理組(加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培

9、養(yǎng)24h);③Apocynin處理組(加100umol/Lapocynin預處理1h后再加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培養(yǎng)24h)。干預結束后分別收集各干預組細胞,采用DCFH-DA處理細胞并使用流式細胞術檢測VSMCs中ROS的產(chǎn)生情況;采用Western blot方法檢測VSMCs中TLR4蛋白的表達情況;采用MTT染色法及改良Boyden小室法檢測VSMCs的增殖和遷移情況。干預結束后分別收集各干預組細胞上清,采用

10、ELISA方法測定炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。
　　結果:
　　1.C57小鼠頸動脈損傷后動脈內(nèi)膜明顯增生,內(nèi)膜/中膜的比值顯著增高,且損傷血管局部TLR4蛋白及外周血炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)水平升高。而TLR4-/-可顯著抑制頸動脈損傷后動脈內(nèi)膜增生及外周血炎癥因子水平。表明TLR4參與調(diào)控頸動脈損傷后動脈內(nèi)膜增生及炎癥反應過程。
　　2.與C57小鼠手術組相比,頸動脈損傷

11、后加用NADPH氧化酶抑制劑apocynin可明顯抑制頸動脈內(nèi)膜增生、損傷血管局部TLR4蛋白表達以及外周血IL-6、IL-1β和TNF-α水平。而TLR4-/-小鼠加用apocynin后頸總動脈內(nèi)膜增生及炎癥因子水平未受到明顯抑制。表明NADPH氧化酶參與調(diào)節(jié)血管損傷后TLR4介導的新生內(nèi)膜形成及炎癥反應過程。
　　3.C57-VSMCs經(jīng)NADPH氧化酶激動劑PDGF-BB刺激后,VMSCs增殖遷移能力增強、TLR4蛋白及炎癥

12、因子表達水平明顯增加。而TLR4-/-可顯著抑制VSMCs增殖遷移及炎癥因子的表達。表明TLR4在VSMC增殖遷移及炎癥反應中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　4.C57-VSMCs經(jīng)NADPH氧化酶激動劑PDGF-BB刺激后,VSMCs內(nèi)ROS的產(chǎn)生明顯增加,而NADPH氧化酶抑制劑apocynin可明顯抑制PDGF-BB誘導的VSMCs內(nèi)ROS生成。且TLR4-/--VSMCs各組間ROS的變化趨勢與C57-VSMCs一致。結合PDG

13、F-BB在促進TLR4蛋白表達中的作用,提示NADPH氧化酶衍生的ROS參與調(diào)節(jié)TLR4蛋白的表達。
　　5.采用NADPH氧化酶抑制劑apocynin下調(diào)NADPH氧化酶活性,抑制ROS產(chǎn)生,可明顯抑制C57-VSMCs增殖遷移以及TLR4蛋白和炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)表達。而TLR4-/--VSMCs加用apocynin后增殖遷移及炎癥因子水平未受到明顯抑制。表明NADPH氧化酶衍生的ROS參與調(diào)節(jié)TLR4