普羅布考對氧化誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的研究.pdf

1、目的：觀察普羅布考對氧化誘導(dǎo)的VSMC增殖和凋亡的作用及對信號蛋白通路中ERK1/2、MKP—1、HO、和ASK—1的影響，揭示普羅布考的雙重作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：⑴采用MTT法和胎盤藍(lán)染色法檢測不同濃度ox—LDL在不同時間點對VSMC增殖的影響，確定ox—LDL誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的最佳濃度和最佳時間。⑵選用ox—LDL最佳促增殖濃度誘導(dǎo)VSMC，加入普羅布考高、中、低劑量，采用GSH和GSSG含量檢測試劑盒計算

2、細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比值變化，采用Western blotting方法檢測細(xì)胞內(nèi)Trx—1濃度變化，觀察普羅布考對ox—LDL誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響。⑶以MTT法評價其對VSMC的細(xì)胞活力影響；以碘化丙啶（PI）染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，評價普羅布考對VSMC周期各時相的影響；MTT法測定一周內(nèi)細(xì)胞活力變化，繪制細(xì)胞生長曲線，觀察普羅布考對ox—LDL誘導(dǎo)的VSMC生長抑制作用；采用劃痕實驗，評價普羅布考抑制VS

3、MC遷移的作用。⑷以western blot方法檢測VSMC細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、p—ERK1/2、MKP—1、HO—1和Trx—1蛋白表達(dá)變化，探討普羅布考抑制ox—LDL誘導(dǎo)VSMC增殖的分子機制。⑸采用MTT法和Annexin V/PI雙染色法檢測不同濃度H2O2對VSMV凋亡的影響，確定H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳濃度。⑹選用H2O2最佳促凋亡濃度誘導(dǎo)VSMC，加入普羅布考高、中、低劑量，采用GSH和GSSG含量檢測試劑盒計算細(xì)胞內(nèi)

4、GSH/GSSG比值變化，采用Western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)Trx—1濃度變化，觀察普羅布考對H2O2誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的影響。⑺以MTT法評價其對VSMC細(xì)胞存活力的影響；Hoechest33258熒光染色法觀察普羅布考對凋亡細(xì)胞形態(tài)的影響；以Annexin V/PI雙染色法定量分析VSMC凋亡百分率的影響；DNA末端原位凋亡染色法（TNNEL）檢測細(xì)胞原位凋亡計數(shù)細(xì)胞凋亡指數(shù)，評價普羅布考對凋亡細(xì)胞形態(tài)及凋亡率

5、的影響。⑻以western blot方法檢測VSMC細(xì)胞內(nèi)ASK—1和Trx—1蛋白表達(dá)水平變化，探討普羅布考抑制ox—LDL誘導(dǎo)VSMC增殖的分子機制。 結(jié)果：①MTT法檢測ox—LDL濃度為35mg·L—1、與細(xì)胞接觸時間為48h時對VSMc的促增殖能力最顯著（P<0．01），隨著時間延長，ox—LDL的促增殖作用逐漸減弱。確定采用35mg·L—1ox—LDL，與細(xì)胞接觸時間為48h時為實驗條件。②ox—LDL35mg·L—

6、1與細(xì)胞共同孵育48h，細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的比值與對照組相比較輕度下降，加入普羅布考高、中、低劑量共同孵育，細(xì)胞內(nèi)GSH/GSS比值呈濃度依賴性升高，Trx—1的表達(dá)顯著增強。③ox—LDL35mg·L—1與VSMC孵育誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，加入普羅布考后，MTT檢測細(xì)胞的吸光度值顯著下降（P<0．01）；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，普羅布考能使ox—LDL刺激的VSMC停滯于G0/G1期、S期，阻止其進入G2/M期，作用隨濃度的增加而

7、增強，并且在G0/G1期前，出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰（凋亡峰）；ox—LDL可刺激VSMC增殖（P<0．05），加普羅布考后細(xì)胞生長明顯減緩；普羅布考可以明顯抑制ox—LDL刺激的VSMC增殖和遷移。④通過western blot實驗發(fā)現(xiàn)普羅布考可明顯抑制p—ERK1/2表達(dá)，并顯著增強MKP—1表達(dá)；使還原型Trx—1和HO—1表達(dá)明顯增強，與ox—LDL刺激組相比均具有顯著性差異（P<0．05），并呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。⑤MTT法檢測H2O

8、2濃度為1000μmol·L—1、與細(xì)胞接觸時間6h細(xì)胞存活力明顯下降，與對照組比較具有顯著性差異（P<0．01）；Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H2O21000μmol·L—1刺激細(xì)胞后細(xì)胞早期凋亡率與對照組比較明顯升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯（P<0．01）。確定采用H2O21000μmol·L—1，作用6h為實驗條件。⑥H2O21000μmol·L—1細(xì)胞共同孵育6h，細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的比值與對照組相比顯著下

9、降（P<0．01），加入普羅布考高、中、低劑量共同孵育，細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的呈濃度依賴性升高；以western blot分析發(fā)現(xiàn)H2O2刺激后Trx—1蛋白表達(dá)抑制作用明顯，加入普羅布考后Trx—1的表達(dá)顯著增強。⑦H2O21000μ·L—1與細(xì)胞孵育6h，MTT法檢測其細(xì)胞OD值明顯下降，加入普羅布考高、中、低劑量共同孵育后，其OD值升高。通過Hoechest33258熒光染色法發(fā)現(xiàn)，H2O2可促使VSMC細(xì)胞凋亡，熒光顯微鏡下見

10、細(xì)胞呈濃染致密熒光，熒光強度大，對照組細(xì)胞呈現(xiàn)均勻彌散的熒光，強度弱。加入普羅布考后，核濃染的細(xì)胞數(shù)減少，并呈現(xiàn)濃度依賴性降低；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激后細(xì)胞的凋亡率明顯增加（P<0．01），而不同濃度的普羅布考處理后，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性降低；TUNEL法實驗發(fā)現(xiàn)，正常對照組的細(xì)胞核多為橢圓形或圓形，呈均一的藍(lán)染，無明顯的凋亡細(xì)胞，H2O2處理組細(xì)胞核呈棕褐色著色，核固縮，染色質(zhì)聚集成團，呈現(xiàn)強陽性改變，普羅布考處理組

11、棕黃色染色的細(xì)胞核減少。⑧1000μmol·L—1H2O2處理VSMC后，與正常對照組相比，細(xì)胞ASK—1蛋白表達(dá)明顯增強，Trx—1蛋白表達(dá)降低，而普羅布考處理可以減少細(xì)胞中ASK—1蛋白的表達(dá)，增加Trx—1的表達(dá)，呈濃度依賴性。 結(jié)論：35mg·L—1的ox—LDL可誘導(dǎo)VSMC增殖，使細(xì)胞內(nèi)的GSH/GSSG比值輕度下降，其促增殖作用與MKP—1活性受抑制，ERK1/2活性增強有關(guān)；普羅布考可以通過增強MKP—1的蛋白表