Shh在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和骨骼肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、Shh通過KLF4調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換
　　背景：眾所周知，血小板源性生長因子（PDGF）可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）表型轉(zhuǎn)換，即從收縮型轉(zhuǎn)換為合成型，而表型轉(zhuǎn)換又是VSMCs增殖的基礎(chǔ)。我們的前期研究證實了PDGF在VSMCs中可以上調(diào)Shh信號表達(dá)，同時抑制Shh信號可以阻止PDGF引起的VSMCs增殖。此外，大量研究提出KLF4作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與了PDGF誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)換的過程

2、，而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)KLF4在Shh功能發(fā)揮中起到重要的作用。這也促使我們推測Shh可能參與了PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換，而KLF4可能參與了此過程。
　　目的：在本研究中，我們主要調(diào)查Shh信號是否參與PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換。其后的機(jī)制研究中，我們進(jìn)一步探討Shh信號是否通過KLF4調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換。本研究將是我們前期實驗結(jié)果的重要補(bǔ)充和完善，同時為VSMCs增殖所導(dǎo)致的疾病提供新的治療思路

3、。
　　方法：
　?。?）首先，我們利用血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）刺激VSMCs，通過Western blot及RT-PCR檢測Shh信號通路及KLF4表達(dá)情況。然后給予伊馬替尼（Imatinib）抑制PDGF受體β（PDGFRβ），給予MEK抑制劑PD98059抑制ERK1/2信號，其后觀察Shh信號通路表達(dá)情況，評估PDGFRβ及ERK1/2信號在PDGF誘導(dǎo)的Shh信號表達(dá)中的作用。
　?。?）然后

4、，利用VSMCs分化型標(biāo)志物α-actin和myocardin，VSMCs去分化型標(biāo)志物去分化型標(biāo)志物Tpm4和SMemb來評估VSMCs的表型狀態(tài)，觀察PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換過程中Shh及KLF4信號表達(dá)情況。利用Shh-siRNA或 Smoothened抑制劑 cyclopamine抑制Shh信號通路，利用Shh-cDNA或重組N-Shh過表達(dá)Shh信號通路，評估Shh信號在PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換中的作用，以及單

5、獨(dú)的Shh信號是否具備促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)換的潛能。
　?。?）最后，利用KLF4-siRNA抑制KLF4信號，并利用N-Shh或PDGF-BB誘導(dǎo) VSMCs去分化，觀察KLF4在PDGF或Shh誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換中的作用。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)PDGF通過活化PDGFRβ/ERK1/2通路促進(jìn)VSMCs Shh信號通路激活。其后我們觀察到PDGF促進(jìn)VSMCs表型轉(zhuǎn)換過程中伴隨Shh/Gli2信號及KLF4活化。在給

6、予PDGF刺激同時抑制Shh信號通路，發(fā)現(xiàn)VSMCs去分化標(biāo)志物Tpm4和SMemb及KLF4信號表達(dá)下降，提示PDGF誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)換及KLF4表達(dá)作用消失。然后在無PDGF刺激下過表達(dá)Shh信號，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的Shh信號可以刺激KLF4表達(dá)同時促進(jìn)VSMCs去分化。最后，我們發(fā)現(xiàn)抑制KLF4后，PDGF及Shh信號誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換作用均消失。
　　結(jié)論：本研究證實了PDGF可誘導(dǎo)VSMCs中Shh信號通路及KLF4激

7、活；Shh及KLF4參與PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換；PDGF通過Shh信號促進(jìn)VSMCs的去分化；而PDGF及Shh信號調(diào)控VSMCs表型轉(zhuǎn)換又是通過活化 KLF4實現(xiàn)的。綜上所述，我們的研究提供了關(guān)于Shh在VSMCs增殖發(fā)病機(jī)制中全新的見解，也就是Shh可以通過KLF4調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的VSMCs表型轉(zhuǎn)換。
　　第二部分、Shh通過Akt/mTOR/p70S6K信號通路在小鼠骨骼肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用
　　

8、背景：肢體缺血再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）是臨床常見疾病。骨骼肌因其較高的代謝活性，在缺血血流恢復(fù)后極易發(fā)生I/R損傷。盡管嚴(yán)重缺血后血流恢復(fù)，骨骼肌損傷持續(xù)存在，后續(xù)可發(fā)生骨骼肌壞死，導(dǎo)致患者截肢，甚至多器官功能障礙。Shh在胚胎后時期對骨骼肌損傷及修復(fù)發(fā)揮了重要作用，同時大量研究也證實了 Shh在骨骼肌缺血中發(fā)揮了保護(hù)作用。然而，目前國內(nèi)尚無關(guān)于Shh在骨骼肌I/R損傷中的作用及機(jī)制研究。
　　目

9、的：本研究通過建立止血帶小鼠后肢I(xiàn)/R損傷模型，評估Shh信號通路在骨骼肌I/R損傷中發(fā)揮的作用。為尋找其中的機(jī)制，我們將研究Shh是否通過經(jīng)典合成代謝通路AKT/mTOR/p70S6K發(fā)揮骨骼肌I/R損傷的保護(hù)作用。最后，我們將探討Shh信號對骨骼肌I/R損傷中相關(guān)的骨骼肌凋亡的影響。我們希望通過這些研究為骨骼肌I/R損傷提供新的治療策略。
　　方法：
　　（1）選取10-14周雄性C57BL/6小鼠，利用止血帶建立小鼠后

10、肢I(xiàn)/R損傷模型，即單側(cè)后肢缺血3h，其后松開止血帶恢復(fù)血流灌注1d，3d，5d，7d及14d，并于不同時間點獲取骨骼肌標(biāo)本。利用Western blot法檢測Shh信號通路相關(guān)蛋白包括Shh，Gli1及Gli2表達(dá)情況。同時，利用免疫熒光法檢測骨骼肌組織Shh信號表達(dá)。
　?。?）為了闡明Shh信號是否參與了骨骼肌 I/R損傷的調(diào)控。通過腹腔注射Smoothened直接抑制劑Cyclopamine以抑制Shh信號通路。相反，通過

11、損傷側(cè)后肢肌肉注射質(zhì)粒編碼人Shh基因（phShh）以過表達(dá)Shh通路。建立模型并取I/R7d損傷小鼠骨骼肌標(biāo)本，通過Western Blot法或者免疫熒光檢測法評估抑制及過表達(dá)Shh信號效率。其后通過H&E染色骨骼肌損傷評分評估骨骼肌損傷程度，通過Masson染色評估骨骼肌纖維化程度。
　?。?）為了研究AKT/mTOR/p70S6K信號通路在骨骼肌I/R損傷中時間-表達(dá)進(jìn)程，利用Western blot檢測不同灌注時間AKT，

12、mTOR，p70S6K以及他們的磷酸化蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步驗證AKT/mTOR/p70S6K信號通路是否參與了Shh誘導(dǎo)的I/R損傷保護(hù)，利用肌肉注射phShh方式過表達(dá)Shh信號，并在I/R7d損傷時間點檢測AKT/mTOR/p70S6K信號通路表達(dá)。其后為進(jìn)一步研究其中機(jī)制，利用phShh過表達(dá)Shh的同時，通過腹腔內(nèi)注射PI3K-mTOR雙向抑制劑NVP-BEZ235抑制AKT/mTOR/p70S6K信號通路，并在I/R7 d損

13、傷時間點檢測AKT/mTOR/p70S6K信號通路表達(dá)、骨骼肌損傷評分及骨骼肌纖維化。
　?。?）本研究中，我們還將評估I/R損傷所致的骨骼肌凋亡。首先，利用Western blot檢測法評估凋亡蛋白Cleaved Caspase3及Bax，抗凋亡蛋白Bcl2的時間-表達(dá)進(jìn)程。其后為進(jìn)一步研究Shh在骨骼肌I/R損傷中的作用，過表達(dá)Shh信號并在I/R7 d損傷時間點檢測凋亡蛋白Cleaved Caspase3及Bax，抗凋亡蛋白

14、Bcl2表達(dá)，同時還利用TUNEL染色評估骨骼肌凋亡水平。
　　結(jié)果：
　?。?）首先，我們發(fā)現(xiàn)I/R損傷可導(dǎo)致Shh，Gli1及Gli2表達(dá)升高，并在再灌注5d達(dá)到峰值，其后表達(dá)量逐漸下降。免疫熒光檢測提示在正常組及I/R1 d組，幾乎不能檢測到Shh信號表達(dá)。在I/R3d，5d組，于骨骼肌基底膜可以觀察到明顯的Shh信號表達(dá)，該信號表達(dá)靠近于骨骼肌肌核或者與骨骼肌肌核共定位。在I/R7d組和I/R14 d組，Shh信號表

15、達(dá)減弱。
　　（2）在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，Shh信號通路抑制劑Cyclopamine治療骨骼肌局部可見壞死區(qū)域，同時H&E染色骨骼肌損傷評分評估增高（P＜0.05），提示抑制 Shh信號通路后骨骼肌 I/R損傷加重。同時Masson三色染色提示Cyclopamine治療組可以觀察到明顯增多的膠原堆積（P＜0.05）。并且，當(dāng)利用肌肉內(nèi)注射phShh過表達(dá)Shh信號通路時，可以觀察到相反的結(jié)果。
　　（3）然后，Western

16、blot結(jié)果提示骨骼肌I/R損傷后早期Shh信號表達(dá)升高同時伴隨AKT，mTOR及p70S6K信號磷酸化水平升高，其后均逐漸降低。phShh治療可導(dǎo)致p-AKT/AKT，p-mTOR/mTOR及p-p70S6K/p70S6K比值明顯升高，而這種作用又可被NVP-BEZ235治療所阻斷。
　?。?）最后，Western blot檢測提示凋亡蛋白Cleaved Caspase3水平及Bax/Bcl2比值在I/R損傷后逐漸升高，均在I/

17、R7d達(dá)到峰值，其后開始下降。而進(jìn)一步探討Shh對凋亡通路影響時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Shh信號可降低I/R7d凋亡蛋白Cleaved Caspase3表達(dá)，及Bax/Bcl2比值（P＜0.05）。而TUNEL染色評估提示外源性phShh治療可降低I/R損傷后骨骼肌凋亡指數(shù)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：Shh信號在胚胎后時期小鼠后肢骨骼肌I/R損傷模型中可被再激活；Shh信號在小鼠后肢骨骼肌I/R損傷中通過AKT/mTOR/p70S6K信號通