缺血后處理減輕骨骼肌缺血-再灌注損傷的分子機(jī)制研究.pdf

1、骨骼肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷常見于溶栓、Fogarty導(dǎo)管取栓、斷肢再植、四肢大血管損傷等恢復(fù)血流后，是臨床亟待解決的重要問題。調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，是減輕I/R損傷最有效的措施。1986年Murry提出缺血預(yù)處理“ischemic preconditioning(IPC)”的概念。IPC多次短暫的缺血再灌注增強(qiáng)對(duì)其之后的較長(zhǎng)時(shí)間的缺血的耐受性，減輕I/R損傷，已經(jīng)被成功的應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)工

2、作。然而，由于缺血時(shí)間不可預(yù)測(cè)，限制其臨床的應(yīng)用。2003年Zhao提出了缺血后處理的概念(ischemic postconditioning，I-postC)，即在再灌注前立刻給予一次或多次短暫重復(fù)心肌I/R，能減輕心肌后續(xù)長(zhǎng)時(shí)間再灌注損傷的現(xiàn)象，該現(xiàn)象在小鼠、大鼠、兔、豬心臟缺血和缺血/再灌注模型上被證實(shí)，存在于人類心臟血管重建術(shù)后；也存在于脊髓、腦、腸、肝、肺等多種器官組織。這種保護(hù)現(xiàn)象可以被短暫的缺氧后處理(hypoxic po

3、stconditioning，H-postC)所模擬，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。外科醫(yī)生可以在擇期手術(shù)或者急診手術(shù)時(shí)進(jìn)行I-postC，并且I-postC作為“損傷后策略”易于應(yīng)用于缺血組織。I-postC的保護(hù)機(jī)制涉及控制灌注條件、減輕微循環(huán)功能障礙、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載和調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性應(yīng)激蛋白(熱休克蛋白、自由基清除酶、金屬硫蛋白等)的合成上調(diào)，闡明其機(jī)制具有十分重要的意義。
　　 微循環(huán)直接影響組織器官血氧供應(yīng)及

4、存活狀態(tài)。微循環(huán)功能障礙是I/R的損傷性表現(xiàn)，也是加重實(shí)質(zhì)細(xì)胞I/R損傷的重要因素，改善微循環(huán)功能是減輕組織I/R損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要機(jī)制。但尚未有研究直接證實(shí)I-postC對(duì)微循環(huán)的影響。
　　 鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)/肌漿網(wǎng)內(nèi)主要的鈣結(jié)合蛋白，通過協(xié)助蛋白質(zhì)折疊、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控。鈣信號(hào)途徑是I/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑。細(xì)胞內(nèi)鈣

5、離子參與調(diào)節(jié)I/R損傷。最近的研究結(jié)果表明，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)及其許多CaN依賴的途徑的功能都依賴ER內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和ER相關(guān)的Ca2+的結(jié)合伴侶。CaN又稱蛋白磷酸酶2B(protein phosphatases2B，PP2B)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。CaN是一個(gè)包含A(CnA)和B(CnB)亞基的的異源二聚體。CaN在多種細(xì)胞過程(

6、包括細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、心臟的生理及代謝調(diào)控和癌癥)中起著重要作用。環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)與內(nèi)源性cyclophilin形成復(fù)合物，可阻斷CaN催化作用，從而抑制細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。既往主要關(guān)注CaN在心肌肥大中的作用，近年來發(fā)現(xiàn)，CaN參與缺血再灌注損傷，但其作用尚有爭(zhēng)議。我們前期研究表明CaN參與I-postC保護(hù)心肌作用。
　　 基于上述，本工作旨在證實(shí)I-postC對(duì)于骨骼肌I/R損傷的保護(hù)涉及改善微

7、循環(huán)的微血管保護(hù)和CaN介導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞直接保護(hù)兩個(gè)方面。為證實(shí)該假說，本工作首先在大鼠后肢I(xiàn)/R損傷模型上證實(shí)I-postC對(duì)骨骼肌I/R損傷的保護(hù)作用及其微血管保護(hù)機(jī)制；進(jìn)一步在體外分離培養(yǎng)的大鼠后肢骨骼肌細(xì)胞H/R模型上，研究I-postC/H-postC對(duì)骨骼肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用以及CaN介導(dǎo)H-postC骨骼肌細(xì)胞保護(hù)分子機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：
　　 一、缺血后處理減輕大鼠骨骼肌缺血/再灌注損傷
　

8、　 本部分實(shí)驗(yàn)旨在觀察I-postC/H-postC對(duì)骨骼肌I/R或H/R損傷的保護(hù)作用。
　　 整體實(shí)驗(yàn)：健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為I/R組、I-postC組、IPC組及假手術(shù)組。觀察各組血流動(dòng)力學(xué)變化，骨骼肌濕干重比值(wet/dry weight ratio，W/D)測(cè)定，骨骼肌組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)變化，血漿乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)濃度及骨骼肌形

9、態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化。骨骼肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：原代培養(yǎng)乳鼠骨骼肌細(xì)胞，隨機(jī)分為(hypoxia/reoxygenation，H/R)組、H-postC組、缺氧預(yù)處理(hypoxic preconditioning，HPC)組、正常對(duì)照組(CON)。觀察各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞存活率變化。Western blot分析葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)、CRT以及CaN表達(dá)變化。
　　 結(jié)果顯示

10、：①整體實(shí)驗(yàn)：I-postC減輕I/R對(duì)心功能的抑制、骨骼肌組織水腫、骨骼肌組織脂質(zhì)過氧化損傷及血漿LDH濃度，并顯著減輕I/R所致骨骼肌結(jié)構(gòu)損傷。I/R誘導(dǎo)GRP78、CRT及CaN表達(dá)上升。與I/R組相比，I-postC可誘導(dǎo)GRP78、CRT及CaN表達(dá)顯著增高。②骨骼肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：H/R引起細(xì)胞凋亡顯著增加，H-postC可顯著減輕細(xì)胞凋亡率；H/R使細(xì)胞存活率降低，H-postC可顯著減輕H/R造成的細(xì)胞壞死。H/R誘導(dǎo)CRT及

11、CaN表達(dá)上升，H-postC可誘導(dǎo)CRT及CaN表達(dá)顯著增高。
　　 二、缺血后處理通過改善微循環(huán)減輕大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)I-postC可以調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源保護(hù)機(jī)制，減輕I/R所致骨骼肌損傷。但I(xiàn)-postC是否通過改善微循環(huán)減輕骨骼肌I/R損傷?這值得深入研究。本部分實(shí)驗(yàn)健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為I/R組、I-postC組、IPC組及假手術(shù)組。采用監(jiān)測(cè)大鼠骨骼肌微循環(huán)改變，以及微血管血流

12、速度及血管內(nèi)徑變化以觀察I-postC對(duì)骨骼肌微循環(huán)的影響，探討I-postC改善骨骼肌I/R損傷的微血管保護(hù)機(jī)制。
　　 結(jié)果顯示：①骨髂肌微循環(huán)的影響：I/R引起脛前肌微循環(huán)障礙，I-postC明顯減輕I/R引起的微循環(huán)障礙；②微血管血流速度：I/R可引起細(xì)靜脈流速減慢，I-postC減輕I/R所致細(xì)靜脈流速減慢；③細(xì)動(dòng)脈內(nèi)徑變化：I/R可引起細(xì)動(dòng)脈攣縮，I-postC減輕I/R所致細(xì)動(dòng)脈攣縮；④細(xì)靜脈內(nèi)徑變化：I/R可引起

13、細(xì)靜脈攣縮，I-postC減輕I/R所致細(xì)靜脈攣縮。
　　 三、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)缺血后處理減輕大鼠骨骼肌缺血/再灌注損傷
　　 前述實(shí)驗(yàn)在骨骼肌組織和細(xì)胞水平上證實(shí)I/H-postC可誘導(dǎo)CaN表達(dá)增加，且CaN表達(dá)與CRT表達(dá)呈正相關(guān)，這提示我們CRT上調(diào)可能介導(dǎo)了I-postC誘導(dǎo)的CaN表達(dá)增加。但CaN活性上調(diào)與骨骼肌I/R損傷保護(hù)及信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)在Wistar大鼠后肢骨骼肌I/R損

14、傷模型和Wistar乳鼠骨骼肌細(xì)胞H/R損傷模型上，觀察I-postC(H-postC)損傷保護(hù)過程中CaN的變化，探討CaN參與I-postC(H-postC)保護(hù)作用；同時(shí)采用CaN抑制劑CsA抑制骨骼肌CaN活性及表達(dá)，并采用pcDNA3.1-Myc-His(B)(pCDB)-caN過表達(dá)CaN，觀察抑制或過表達(dá)CaN后后處理對(duì)骨骼肌I/R(H/R)損傷的影響。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①整體實(shí)驗(yàn)：CsA顯著抑制骨骼肌組織CaN表

15、達(dá)及活性，顯著抑制I-postC保護(hù)作用，骨骼肌水腫加重，MDA及LDH濃度增加，②骨骼肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：CsA顯著抑制骨骼肌細(xì)胞CaN表達(dá)及活性，顯著抑制H-postC保護(hù)作用，細(xì)胞凋亡率較H-postC組顯著升高，細(xì)胞存活率較H-postC組顯著降低；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，CaN表達(dá)及活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率較H-postC組顯著降低，細(xì)胞存活率較H-postC組顯著增高。
　　 通過上述分析，得出如下實(shí)驗(yàn)結(jié)論：①后處理可以調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性保