細(xì)絲蛋白與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)性的研究.pdf

1、背景： 細(xì)絲蛋白(Filamin，F(xiàn)LN)參與血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的分化遷移、炎癥及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面進(jìn)程，在動(dòng)脈發(fā)育-成熟-功能健全-老化以及病理性動(dòng)脈硬化的過程中具有重要生物學(xué)意義。利用RNA干擾技術(shù)使FLNmRNA表達(dá)降低(knockdown)，抑制FLN在VSMC中的生成，減少或阻斷收縮表型VSMC向合成表型轉(zhuǎn)化，從而改變病理狀態(tài)下VSMC的功能，有可能達(dá)到從基因水平上預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用，為腦血管病基因

2、治療開辟新的途徑及基因靶點(diǎn)。 材料與方法： 培養(yǎng)兔VSMC，設(shè)計(jì)多條可誘發(fā)FLNmRNA表達(dá)沉默的SiRNA片段，構(gòu)建質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況鑒定轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定FLNmRNA抑制效果。Westernblot檢測(cè)FLN蛋白的表達(dá)。利用ox-LDL培養(yǎng)正常及轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，MTT及3H-TdR細(xì)胞內(nèi)摻入法等了解細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞周期及凋亡壞死率。免疫熒光觀察凋亡、細(xì)胞

3、骨架及細(xì)胞形態(tài)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞多種蛋白表達(dá)情況。電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 設(shè)計(jì)的三條SiRNA均可有效抑制FLNmRNA的表達(dá)，其中7-1、7-2片段抑制效果最明顯，可達(dá)60％以上。各組FLN蛋白/Actin蛋白的比值與正常細(xì)胞或空載體細(xì)胞組相比均明顯下降。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力明顯低于正常組細(xì)胞，凋亡壞死比率相似。兩組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞骨架構(gòu)型及超微結(jié)構(gòu)則未見明顯差異。給予ox-LDL后正常組細(xì)胞增殖能

4、力明顯增強(qiáng)，α-SM-Actin表達(dá)降低而FLN表達(dá)增高，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能學(xué)改變均提示多數(shù)VSMC向合成表型轉(zhuǎn)化。與正常細(xì)胞組相比，F(xiàn)LN表達(dá)降低的轉(zhuǎn)染VSMC由收縮向合成表型轉(zhuǎn)化的程度較低，凋亡比例亦低于正常細(xì)胞組；細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)受損程度相對(duì)較輕。 結(jié)論： RNAi通過滅活或降低目的基因的表達(dá)，可以深入研究目的基因的功能。利用RNAi抑制FLN在VSMC中的生成，有效的減少病理狀態(tài)下收縮表型VSMC向合成表型轉(zhuǎn)化