細絲蛋白與血管平滑肌細胞表型轉化相關性的研究.pdf

1、背景： 細絲蛋白(Filamin，F(xiàn)LN)參與血管平滑肌細胞(VSMC)的分化遷移、炎癥及細胞信號轉導等多方面進程，在動脈發(fā)育-成熟-功能健全-老化以及病理性動脈硬化的過程中具有重要生物學意義。利用RNA干擾技術使FLNmRNA表達降低(knockdown)，抑制FLN在VSMC中的生成，減少或阻斷收縮表型VSMC向合成表型轉化，從而改變病理狀態(tài)下VSMC的功能，有可能達到從基因水平上預防或治療動脈粥樣硬化的作用，為腦血管病基因

2、治療開辟新的途徑及基因靶點。 材料與方法： 培養(yǎng)兔VSMC，設計多條可誘發(fā)FLNmRNA表達沉默的SiRNA片段，構建質粒載體并轉染細胞，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況鑒定轉染效率，實時熒光定量PCR鑒定FLNmRNA抑制效果。Westernblot檢測FLN蛋白的表達。利用ox-LDL培養(yǎng)正常及轉染細胞后，MTT及3H-TdR細胞內摻入法等了解細胞生長增殖情況。流式細胞儀測量細胞周期及凋亡壞死率。免疫熒光觀察凋亡、細胞

3、骨架及細胞形態(tài)。免疫組織化學法檢測細胞多種蛋白表達情況。電鏡觀察細胞超微結構變化。 結果： 設計的三條SiRNA均可有效抑制FLNmRNA的表達，其中7-1、7-2片段抑制效果最明顯，可達60％以上。各組FLN蛋白/Actin蛋白的比值與正常細胞或空載體細胞組相比均明顯下降。轉染組細胞的增殖能力明顯低于正常組細胞，凋亡壞死比率相似。兩組細胞的形態(tài)學、細胞骨架構型及超微結構則未見明顯差異。給予ox-LDL后正常組細胞增殖能

4、力明顯增強，α-SM-Actin表達降低而FLN表達增高，細胞形態(tài)結構及功能學改變均提示多數(shù)VSMC向合成表型轉化。與正常細胞組相比，F(xiàn)LN表達降低的轉染VSMC由收縮向合成表型轉化的程度較低，凋亡比例亦低于正常細胞組；細胞骨架及超微結構受損程度相對較輕。 結論： RNAi通過滅活或降低目的基因的表達，可以深入研究目的基因的功能。利用RNAi抑制FLN在VSMC中的生成，有效的減少病理狀態(tài)下收縮表型VSMC向合成表型轉化