肺、體血管平滑肌細胞線粒體的異質(zhì)性.pdf

1、第一部分從肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞中提取線粒體方法的對比
　　 目的：對比提取肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞（PASMC、FASMC、FVSMC）線粒體方法的成功率差異。
　　 方法：斷頸法處死150g左右的SD雄性大鼠，分離肺動脈、股動脈、股靜脈血管放置于冰浴的D-Hank’s液中，在顯微鏡下去除血管外膜內(nèi)膜，獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿，勻漿后加入蛋白酶抑制劑cocktail。勻漿液放入EP管，4

2、℃600g離心5min，取上清置于另一EP管內(nèi)，4℃5000g離心10min，所獲沉淀即為線粒體。方法改動：梯度離心時兩次離心力改為1000g，10min/10000g，15min；600g，5min/7000g，10min兩種搭配。
　　 結(jié)果：在三種離心速度搭配的改動中，線粒體提取成功率有顯著提高。離心力搭配為600g，5min/5000g，10min時，成功率為47.4％；離心力搭配為1000g，10min/10000g，

3、15min時，成功率為50％；離心力搭配為600g，5min/7000g，10min時，成功率為89.8％。
　　 結(jié)論：當(dāng)離心力搭配為600g，5min/7000g，10min時，提取線粒體的成功率最高。
　　 第二部分肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞中線粒體數(shù)量和活性的差異
　　 目的：1.提取線粒體后對比PASMC、FASMC、FVSMC中線粒體數(shù)量的差異。2.用ELISA測定檸檬酸合成酶（CS）含量間接反

4、應(yīng)線粒體含量。3.通過對比三種平滑肌細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）的活性差異，間接反映三種平滑肌細胞中線粒體活性的差異。
　　 方法：1.線粒體的提?。簲囝i法處死150g的SD雄鼠，取出肺動脈、股動脈、股靜脈，放置于冰浴的D-Hank’s液中，在顯微鏡下去除血管外膜、內(nèi)膜，獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿，勻漿后加入蛋白酶抑制劑，之后勻漿液放入EP管4℃600g離心5min，取出上清液放入新的EP管，4℃7000g離心

5、10min，所獲沉淀即為平滑肌層線粒體。2.線粒體計數(shù)：線粒體重懸于100μL配好的Mito-track-green染料中，放置在37℃
　　 孵育30min，染色結(jié)束后，4℃7000g離心10min，棄去上清，沉淀重懸于勻漿緩沖液，震蕩混勻后4℃7000g離心15min，即獲得被Mito-track-green著染的純化線粒體。取獲得的已染色的線粒體懸液10μL加入細胞計數(shù)板，在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)數(shù)熒光亮點，之后通過細胞計

6、數(shù)板計數(shù)得出線粒體懸液濃度。3.蛋白濃度測定：取第一次離心后所得的上清液40μL測定蛋白含量。線粒體數(shù)/蛋白質(zhì)量=單位質(zhì)量蛋白所含的線粒體數(shù)。4.檸檬酸合成酶含量的測定：取1步驟中第一次離心后的上清1mL，分為五份，-20℃保存，按ELISA試劑盒說明書測檸檬酸合成酶含量。5.琥珀酸脫氫酶活性測定：將提取的線粒體重懸于100μL組織裂解液，4℃冰浴中裂解1小時，之后4℃120000r/min離心5min。取40μL上清液測蛋白濃度，50

7、μL上清液測SDH活性。活性測定方法按照試劑盒說明書操作。
　　 結(jié)果：1.線粒體計數(shù)結(jié)果：PASMC中線粒體數(shù)為2×106個/mg pro（n=5），F(xiàn)ASMC中線粒體數(shù)為3.5×106個/mg pro（n=5），F(xiàn)VSMC中線粒體數(shù)為5.6×106個/mg pro（n=5）；三種血管平滑肌細胞線粒體數(shù)量存在顯著性差異（p＜0.05）。
　　 2．檸檬酸合成酶含量測定結(jié)果：（1）PASMC中CS含量為4.43ng/mg

8、 pro、FASMC中CS含量為8.46ng/mg pro，F(xiàn)VSMC中CS含量為7.23ng/mg pro。PASMC與FASMC兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(n=3，p＜0.05)；（2）PASMC中單個線粒體CS含量為1.99×10-3pg、FASMC中單個線粒體CS含量為1.27×10-3pg、FVSMC中單個線粒體CS含量為2.40×10-3pg，F(xiàn)ASMC與FVSMC兩者間有差異(n=3，p＜0.05)。
　　 3．琥珀

9、酸脫氫酶活性檢測結(jié)果：FASMC與FVSMC中SDH活性比PASMC中SDH活性高，F(xiàn)ASMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的210.36％（n=6，p＜0.05）；FVSMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的243.45％（n=9，p＜0.05）。
　　 結(jié)論：1.股靜脈血管平滑肌中線粒體數(shù)量最多，股動脈其次，肺動脈最少。2．PASMC中CS含量最低，F(xiàn)ASMC中CS含量最高；就單個線粒體而言，F(xiàn)VSMC中CS含量最