PPARβ-δ對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH，subarachnoid hemorrhage）是一種高發(fā)病率、高致死致殘率的神經(jīng)危重癥，以動(dòng)脈瘤性SAH居多。以往研究認(rèn)為腦血管痙攣（CVS，cerebral vasospasm）是SAH后嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致高致殘致死率的首要原因，也是導(dǎo)致SAH后遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙（DIND，delayed ischemic neurological deficit）主要原因。目前研究則認(rèn)為，SAH后腦血

2、管自動(dòng)調(diào)節(jié)功能失衡是導(dǎo)致DIND、腦腫脹、血管源性腦水腫等的主要原因。血管平滑肌細(xì)胞（VSMC，vascular smooth muscle cells）作為血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基本結(jié)構(gòu)和功能組成成分，在穩(wěn)定腦血管緊張性、調(diào)節(jié)腦血流方面發(fā)揮著重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ（PPARβ/δ，peroxisome proliferator activated receptorβ/δ）被證實(shí)能調(diào)節(jié)VSMC增殖，維持血管的穩(wěn)態(tài)。在本研究中

3、，通過構(gòu)建腦VSMC血紅蛋白刺激和大鼠實(shí)驗(yàn)性SAH模型，研究PPARβ/δ對腦VSMC表型轉(zhuǎn)化以及對腦血管重塑的影響，并初步探討其潛在機(jī)制，為臨床治療遲發(fā)性腦缺血提供新的思路。
　　方法：
　　1.SD大鼠大腦動(dòng)脈環(huán)及基底動(dòng)脈原代腦VSMC，進(jìn)行細(xì)胞鑒定和傳代培養(yǎng)，6代以內(nèi)的腦VSMC用于后續(xù)試驗(yàn)。不同濃度的血紅蛋白（Hb，hemoglobin）（1μM、5μM、10μM、15μM、20μM）分別孵育生長狀態(tài)良好的腦VSMC

4、24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb。免疫熒光雙標(biāo)半定量α-SMA和Smemb表達(dá)情況。
　　2.1μM GW0742孵育腦VSMC24小時(shí)后，或Ad-PPARβ/δ轉(zhuǎn)染腦VSMC48小時(shí)后，再以10μM Hb刺激GW0742或Ad-PPARβ/δ預(yù)處理的腦VSMC24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN

5、、Smemb，以及PPARβ/δ表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)半定量α-SMA和Smemb表達(dá)情況。
　　3.50nM si-PPARβ/δ或NC-siRNA轉(zhuǎn)染腦VSMC48小時(shí)以后，再以10μM Hb刺激腦VSMC24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、Smemb，以及PPARβ/δ表達(dá)情況。
　　4.在GW0742或Ad-PPARβ/δ分別預(yù)處理腦VSMC30分鐘之前，用1μM PI3K/A

6、KT信號(hào)通路抑制劑LY294002處理細(xì)胞。再分別用10μM Hb刺激腦VSMC24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb，以及p-Akt、Myocardin表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)檢測SRF半定量和核轉(zhuǎn)移情況。
　　5.構(gòu)建SD大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺SAH模型，并通過側(cè)腦室注射Ad-PPARβ/δ或 Ad-GFP。使用改良的神經(jīng)功能行為學(xué)Garcia評(píng)分和Beam Bal

7、ance評(píng)分檢測大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)改變。取大腦動(dòng)脈環(huán)和基底動(dòng)脈提取組織總蛋白，Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、Smemb，以及PPARβ/δ表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)半定量基底動(dòng)脈α-SMA、Smemb的表達(dá)情況，并測量其管壁厚度和血管內(nèi)徑長度。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的Hb（1μM、5μM、10μM、15μM、20μM）分別刺激生長狀態(tài)良好的腦VSMC24小時(shí)后，Western Bl

8、ot或熒光免疫雙標(biāo)檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb。隨著Hb濃度逐漸增加，α-SMA表達(dá)量逐漸下降，Smemb表達(dá)量則逐漸升高。當(dāng)Hb濃度到達(dá)10μM時(shí)，α-SMA和Smemb表達(dá)量的變化達(dá)到最高峰。但進(jìn)一步增加Hb濃度，α-SMA和Smemb表達(dá)量則都下降，后續(xù)試驗(yàn)以10μM為最佳刺激濃度。同Control組相比，Hb組α-SMA和SM-MHC表達(dá)量明顯下降，相反OPN和Smemb表達(dá)量則明顯

9、升高。熒光免疫雙標(biāo)也證實(shí)Hb組α-SMA表達(dá)量明顯下降，Smemb表達(dá)量則明顯升高。
　　2.1μM GW0742預(yù)處理腦VSMC24h后，或Ad-PPARβ/δ預(yù)處理腦VSMC48h后，再以10μM Hb刺激腦VSMC24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC、OPN、Smemb，以及PPARβ/δ表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)半定量α-SMA和Smemb表達(dá)情況。10μM Hb刺激腦VSM

10、C24小時(shí)，Hb組α-SMA和SM-MHC表達(dá)量明顯下降，相反OPN和Smemb表達(dá)量則明顯升高，同時(shí)PPARβ/δ的表達(dá)量也明顯下降。但GW0742組或 Ad-PPARβ/δ組α-SMA和SM-MHC表達(dá)量則明顯逆轉(zhuǎn)，出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，而OPN和Smemb表達(dá)量則出現(xiàn)明顯的下降。免疫熒光雙標(biāo)證實(shí)GW0742組α-SMA表達(dá)升高，Smemb表達(dá)量則下降。
　　3.50nM si-PPARβ/δ或NC-siRNA轉(zhuǎn)染腦VSMC48小時(shí)

11、以后，再以10μM Hb刺激腦VSMC24小時(shí)。Western Blot檢測VSMC表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)記蛋白α-SMA、Smemb，以及PPARβ/δ表達(dá)情況。相比于NC-siRNA組，si-PPARβ/δ組PPARβ/δ表達(dá)明顯被抑制。雖然si-PPARβ/δ進(jìn)一步抑制了PPARβ/δ表達(dá)量，但α-SMA和 Smemb的表達(dá)量相比于NC-siRNA組或Hb組無明顯變化。
　　4.1μM PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002預(yù)

12、處理腦VSMC后，p-Akt表達(dá)量明顯下降。同時(shí)GW0742或Ad-PPARβ/δ抑制Hb誘導(dǎo)的腦VSMC表型轉(zhuǎn)化的作用明顯被抑制，相較于無LY294002預(yù)處理組α-SMA和SM-MHC表達(dá)量明顯下降，而OPN和Smemb表達(dá)量則明顯上升。同時(shí)，LY294002預(yù)處理組Myocardin表達(dá)量也明顯下降。免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，Ad-PPARβ/δ明顯促進(jìn)SRF向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，而LY294002預(yù)處理后則明顯抑制了SRF的核轉(zhuǎn)移。
　　5

13、.隨著SAH造模后時(shí)間逐漸增加，α-SMA表達(dá)量逐漸降低，而Smemb表達(dá)量則逐漸上升。但是第3天和第5天表達(dá)量則無明顯差異，后續(xù)實(shí)驗(yàn)則以3天為觀測時(shí)間。SAH后3天PPARβ/δ表達(dá)明顯下降，同時(shí)α-SMA表達(dá)量也下降。但Ad-PPARβ/δ組，PPARβ/δ表達(dá)明顯上升，同時(shí)上調(diào)α-SMA的表達(dá)，抑制Smemb的表達(dá)。基底動(dòng)脈免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，同SAH組或Ad-GFP組相比，Ad-PPARβ/δ組，基底動(dòng)脈管壁厚度明顯降低，而血管內(nèi)

14、徑則明顯增加。改良的神經(jīng)功能行為學(xué)Garcia評(píng)分和Beam Balance神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分證實(shí)，Ad-PPARβ/δ能明顯改善SD大鼠SAH后神經(jīng)功能的缺失，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1.Hb能明顯促進(jìn)體外原代培養(yǎng)的腦VSMC由收縮型向合成分泌型轉(zhuǎn)換，使收縮型標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC表達(dá)量明顯下降，而合成分泌型標(biāo)記蛋白OPN和Smemb表達(dá)量明顯上升。
　　2.PPARβ/δ能明顯抑制Hb誘導(dǎo)的腦V

15、SMC表型轉(zhuǎn)化，使收縮型標(biāo)記蛋白α-SMA、SM-MHC表達(dá)量明顯上升，同時(shí)抑制合成分泌型標(biāo)記蛋白OPN和Smemb的表達(dá)。
　　3.PPARβ/δ通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)p-Akt、Myocardin表達(dá)和SRF核轉(zhuǎn)移，來發(fā)揮穩(wěn)定腦VSMC表型的作用。
　　4.PPARβ/δ明顯抑制實(shí)驗(yàn)性SD大鼠SAH后腦VSMC表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)改善基底動(dòng)脈病理性血管重塑：降低血管管壁厚度；增加血管內(nèi)徑長度，并促進(jìn)SD大鼠神經(jīng)