蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管核因子-κB激活及調(diào)控的相關(guān)研究.pdf

1、自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH；下文SAH都特指自發(fā)性SAH)主要是由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起,是臨床上較常見的致死、致殘性疾病,占所有中風(fēng)患者的5％左右,在普通人群中的發(fā)生率約為8/10萬人。盡管近年來診斷水平、麻醉技術(shù)、手術(shù)及圍手術(shù)期處理水平在不斷提高,但SAH的預(yù)后仍未得到明顯改觀,數(shù)據(jù)顯示SAH病人的死亡率在45％左右,而幸存者中大概三分之一左右生活不能自理,有較高的致殘率。而致死、致殘的

2、主要因?yàn)槌薙AH起病急驟等自身特點(diǎn)之外,臨床上對(duì)其缺乏有效的治療方法和手段也是影響本病轉(zhuǎn)歸的主要因素,而治療手段的缺乏則要?dú)w咎于目前對(duì)于SAH病理生理機(jī)制認(rèn)識(shí)的局限性。
　　 腦血管痙攣被認(rèn)為是SAH患者死亡和殘疾的主要因?yàn)?。腦血管痙攣主要發(fā)生于破裂動(dòng)脈瘤周圍的大血管,可導(dǎo)致嚴(yán)重的、多灶性的腦缺血,從而造成不良的臨床轉(zhuǎn)歸。雖然對(duì)腦血管痙攣的臨床及基礎(chǔ)研究很多,但至今腦血管痙攣仍是一種缺乏有效治療的嚴(yán)重病理狀態(tài)。
　　

3、越來越多的證據(jù)表明炎性反應(yīng)是造成腦血管痙攣的一個(gè)重要機(jī)制,臨床和實(shí)驗(yàn)研究都發(fā)現(xiàn)SAH后腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)及血清中細(xì)胞因子(cytokines)及內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(endothelial adhesion molecules)水平明顯升高。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)的快轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB家族包括p50、RelA/p65、c-Rel、RelB和p5

4、2這5個(gè)亞單位,他們之間再組成二聚體以實(shí)現(xiàn)其功能。在靜息狀態(tài)下NF-κB位于細(xì)胞漿內(nèi),與其抑制蛋白IκB保持結(jié)合狀態(tài)。NF-κB一旦被激活,就與IκB分離并轉(zhuǎn)位入核,可以調(diào)控細(xì)胞因子、趨化分子(chemokines)和粘附分子等在炎性分子的轉(zhuǎn)錄。因此,很多與炎性相關(guān)的疾病都與NF-κB密切相關(guān)?，F(xiàn)已證實(shí),NF-κB在腦缺血(cerebral ischemia)及創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury)中起著非常重要的

5、作用。因此,可以推斷NF-κB在腦血管痙攣的發(fā)生、發(fā)展中或有著重要的作用,它可通過炎性反應(yīng)引起腦血管痙攣或影響腦血管痙攣的程度,NF-κB或許是腦血管痙攣治療中的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。事實(shí)上,在SAH動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明NF-κB激活后通過調(diào)控炎性反應(yīng)機(jī)制引起腦血管痙攣。但是在腦血管痙攣發(fā)生中起著極為重要作用的平滑肌細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致血管痙攣的氧合血紅蛋白(oxyhemoglobin)對(duì)NF-κB的激活情況目前尚無系統(tǒng)研究,本研究的主要目的之一就是在體

6、外探討不同濃度氧合血紅蛋白對(duì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musclecells)內(nèi)NF-κB激活的影響,以進(jìn)一步揭示腦血管痙攣與平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB關(guān)系的確切機(jī)制。
　　 此外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)可以有效的緩解腦血管痙攣,從而改善SAH患者的預(yù)后,但是對(duì)其治療機(jī)制的認(rèn)識(shí),目前還非常有限。因此本研究結(jié)合前面的研究,對(duì)EPO治療腦血管痙攣的作用再次

7、在兔二次注血SAH模型中證實(shí)的前提下,通過觀察其對(duì)NF-κB的調(diào)控作用,來闡明EPO對(duì)腦血管痙攣治療的機(jī)制。
　　 因此,本研究主要是通過體外研究,證實(shí)氧合血紅蛋白可激活培養(yǎng)的腦血管平滑肌細(xì)胞中的NF-κB這一假說。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究目前臨床上證實(shí)對(duì)腦血管痙攣有較好治療作用的EPO對(duì)SAH后血管內(nèi)NF-κB活性的調(diào)控以及與其治療作用之間的關(guān)系。由此,也更進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB在腦血管痙攣中的重要作用。
　　 第一部分

8、 不同濃度氧合血紅蛋白對(duì)體外培養(yǎng)腦血管平滑肌細(xì)胞NF-κB DNA結(jié)合活性的影響
　　 目的:通過體外實(shí)驗(yàn),觀察氧合血紅蛋白對(duì)培養(yǎng)的腦血管平滑肌細(xì)胞密度及NF-κB激活的影響,以證實(shí)氧合血紅蛋白可通過影響腦血管平滑肌細(xì)胞的形態(tài)并激活NF-κB而最終引起腦血管痙攣。
　　 方法:取兔基底動(dòng)脈進(jìn)行腦血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)并用α-actin的免疫組化進(jìn)行平滑肌細(xì)胞鑒定。取該動(dòng)物的自身的血液制作氧合血紅蛋白。用不同濃度(1 μ

9、mol/L-100 μmol/L)的氧合血紅蛋白處理培養(yǎng)的腦血管平滑肌細(xì)胞,觀察其形態(tài)學(xué)及細(xì)胞密度變化,并通過測定NF-κB的DNA結(jié)合活性(凝膠電泳遷移分析法)評(píng)估NF-κB的激活情況。
　　 結(jié)果:氧合血紅蛋白刺激后腦血管平滑肌細(xì)胞都表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)的改變,主要表現(xiàn)為貼壁率下降,細(xì)胞壞死脫落增加,細(xì)胞分布較稀疏,部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,且隨氧合血紅蛋白濃度的增加而愈加嚴(yán)重。但是在24小時(shí)時(shí)只有100μmol/L,組有明顯的細(xì)胞數(shù)

10、量減少(與對(duì)照組比較P<0.05),10μmol/L組在48小時(shí)時(shí)細(xì)胞數(shù)量開始明顯較少(與對(duì)照組比較P<0.05)。平滑肌細(xì)胞的NF-κB的DNA結(jié)合活性在經(jīng)氧合血紅蛋白處理后(>10μmol/L)明顯增高(與對(duì)照組比較P<0.05),不呈劑量依賴性,以10μmol/L及50μmol/L組為最高(與對(duì)照組相比P<0.01)。
　　 結(jié)論:NF-κB的DNA結(jié)合活性在經(jīng)氧合血紅蛋白處理的腦血管平滑肌細(xì)胞中有明顯改變,證明了腦血管痙

11、攣的主要致痙攣源氧合血紅蛋白可以激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的NF-κB,同時(shí)提示了NF-κB在CVS發(fā)生時(shí)是腦血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)通路。
　　 第二部分 EPO治療兔SAH后腦血管痙攣及對(duì)腦血管NF-κB調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:在兔SAH模型中驗(yàn)證EPO對(duì)遲發(fā)性腦血管痙攣的療效,同時(shí)觀察其對(duì)腦血管NF-κB激活情況的影響。
　　 方法 取雄性新西蘭白兔60只,隨機(jī)分為對(duì)照組、SAH組和EPO治療組,每組20只(n

12、=20)。采用枕大池二次注血SAH模型誘發(fā)遲發(fā)性腦血管痙攣。EPO注射劑量為1000IU/kg,1次/8小時(shí)；對(duì)照組和SAH組均給予EPO的溶劑(含人血清蛋白2.5 mg/ml、氯化鈉352mmol/L及蒸餾水),以1ml/kg經(jīng)腹腔注射,連續(xù)腹腔注射15次。造模后第5天處死動(dòng)物,取基底動(dòng)脈,HE染色后測定基底動(dòng)脈管腔橫截面積,并用凝膠電泳遷移分析法檢測NF-κB活性。
　　 結(jié)果 ①對(duì)照組、SAH組和EPO治療組兔的基底動(dòng)脈管

13、腔截面積分別為(0.420±0.008)mm2、(0.225±0.025)mm2和(0.353±0.085)mm2。SAH組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明模型制作成功、有效；EPO治療組與SAH組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明EPO治療可以緩解腦血管痙攣程度；EPO治療組與對(duì)照組比較,仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明EPO治療并不能完全緩解腦血管痙攣,EPO并不能對(duì)抗引起腦血管痙攣的全部機(jī)制,或者能夠?qū)@些

14、機(jī)制都能完全逆轉(zhuǎn)。②對(duì)照組、SAH組和EPO治療組的NF-κB活性灰度值分別為:1.180±0.079、9.350±0.691和6.220±0.583,SAH組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),再次表明SAH后腦血管NF-κB被激活；EPO治療組與對(duì)照組、SAH組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),這說明了EPO可以抑制腦血管NF-κB的激活、調(diào)控其表達(dá),但是因其并非NF-κB的特異性抑制劑,EPO并不能完全抑制SAH后N

15、F-κB的激活。
　　 結(jié)論 腦血管內(nèi)的NF-κB在兔二次注血SAH模型中被激活；一定劑量的EPO治療(1000IU/kg)可以部分抑制SAH后NF-κB的激活,并能通過調(diào)控該NF-κB的激活,從而緩解SAH后的遲發(fā)性腦血管痙攣。
　　 通過這兩部分研究,首次系統(tǒng)的證實(shí)了作為主要致痙攣源的氧合血紅蛋白,可以引起腦血管平滑肌細(xì)胞中表征NF-κB活性的NF-κB的DNA結(jié)合活性增高。表示氧合血紅蛋白可以激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的NF

16、-κB,使其活性增高。而通過EPO在動(dòng)物SAH模型內(nèi)下調(diào)SAH后的NF-κB活性后發(fā)現(xiàn)腦血管痙攣也能明顯減輕,這也進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB在腦血管痙攣中的作用,同時(shí)也再次證實(shí)了EPO對(duì)腦血管痙攣的治療作用,從炎性反應(yīng)及其上游調(diào)控因子NF-κB這一方面揭示了EPO治療腦血管痙攣的機(jī)制。這將為今后在體外平滑肌細(xì)胞中研究氧合血紅蛋白通過影響何種方式、何種因子激活NF-κB從而引起腦血管痙攣以及EPO通過那種具體的方式抑制NF-κB從而減輕腦血管