MiR--4463在動(dòng)脈硬化閉塞癥中介導(dǎo)JNK通路對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、目的：動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans，ASO)已成為周圍血管疾病中最常見(jiàn)的病種，嚴(yán)重危害人類健康。而血管平滑肌細(xì)胞的參與是ASO的重要病理，但其具體的分子機(jī)制尚不完全清楚，因此對(duì)于ASO的早期診斷及治療顯得尤為迫切和必要。近年來(lái)，隨著非蛋白機(jī)制和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制研究的逐漸深入，多數(shù)學(xué)者將研究聚焦于探索MicroRNAs(miRNAs)與ASO之間的關(guān)系。在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，我們通過(guò)miRNA芯片方法

2、篩選，發(fā)現(xiàn)miR-4463在正常人群血漿與ASO患者之間存在顯著性差異?；谝陨虾Y選結(jié)果，我們運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證miR-4463在ASO患者和對(duì)照人群血漿中的表達(dá)水平，并進(jìn)行臨床分期比較。因此，本研究，我們主要探討miR-4463對(duì)ASO疾病中的血管平滑肌細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　方法：我們利用經(jīng)典造模劑氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)條件模擬動(dòng)脈硬化

3、疾病發(fā)生，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)miR-4463分別在ox-LDL干預(yù)條件下的血管平滑肌細(xì)胞與其在對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)差異及miR-4463在ASO患者和對(duì)照人群血漿中的表達(dá)差異。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-4463mimic和miR-4463inhibitor調(diào)控miR-4463的表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)周期實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)調(diào)控miR-4463水平對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響。根據(jù)功能試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)miR-4463可

4、能參與調(diào)節(jié)的靶基因及相關(guān)的下游通路，并選擇JNK這一與細(xì)胞遷移及平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的通路作為進(jìn)一步探究的對(duì)象。
　　結(jié)果：通過(guò)miRNA芯片方法篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-4463在ASO患者血漿中的含量較對(duì)照的健康人群表達(dá)顯著降低53％(P=0.0145)，通過(guò)RT-qPCR發(fā)現(xiàn)miR-4463在ox-LDL干預(yù)條件下的血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)較正常對(duì)照組的表達(dá)下降75％(P=0.0024)。周期實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)等結(jié)果顯示

5、，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-4463mimic后與NC組相比遷移細(xì)胞數(shù)下降了57.5％(P＜0.001)，但miR-4463inhibitor組較NC組的遷移細(xì)胞數(shù)量提高100.1％(P＜0.001)，提示上調(diào)miR-4463抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移，而下調(diào)miR-4463促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移。而細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，miR-4463mimic和miR-4463inhibitor組與NC組之間并無(wú)明顯差異。通過(guò)進(jìn)一步Western Bl

6、ot對(duì)遷移相關(guān)標(biāo)志蛋白N-Cadherin和E-Cadherin進(jìn)行檢測(cè)。在股動(dòng)脈組織中，N-cadherin蛋白在ASO患者組較正常對(duì)照組表達(dá)上調(diào)411.7％(P＜0.001)而E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)50.4％(P=0.0099)。在體外細(xì)胞水平上，N-cadherin在轉(zhuǎn)染miR-4463mimic的HASMCs中較NC組下調(diào)61.3％(P＜0.001)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組上調(diào)86％(P

7、＜0.001);而E-cadherin在轉(zhuǎn)染miR-4463mimic的HASMCs中較NC組上調(diào)89.7％(P=0.0092)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組下調(diào)67.3％(P=0.024)。對(duì)遷移標(biāo)志蛋白的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步確證miR-4463對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的遷移有重要作用。從細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-4463mimic能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞維持收縮型狀態(tài)，而miR-4463inhibitor能促進(jìn)血管平滑

8、肌細(xì)胞向分泌型轉(zhuǎn)換。因此，我們通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了血管平滑肌細(xì)胞收縮型的標(biāo)志蛋白SMA及分泌型標(biāo)志蛋白OPN，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣提示，在股動(dòng)脈組織中，OPN蛋白在ASO患者組較正常對(duì)照組上調(diào)1080％(P＜0.001)而SMA蛋白下調(diào)45％(P=0.0105);在體外細(xì)胞水平上，OPN在轉(zhuǎn)染miR-4463mimic的HASMCs中較NC組下調(diào)34％(P=0.0291)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組

9、上調(diào)34％(P=0.0422);而SMA在轉(zhuǎn)染miR-4463mimic的HASMCs中較NC組上調(diào)43％(P=0.0058)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor的實(shí)驗(yàn)組較NC組下調(diào)57％(P=0.0078)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-4463mimic與NC組對(duì)比，OPN的表達(dá)下調(diào)而SMA的表達(dá)上調(diào);轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor組與NC組對(duì)比，OPN的表達(dá)上調(diào)而SMA蛋白的表達(dá)下調(diào)?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-4463可能參

10、與平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換。而對(duì)于miR-4463下游通路的研究，我們將平滑肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC、miR-4463mimic、miR-4463inhibitor后并分為三組，通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P-JNK/JNK蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-4463mimic后P-JNK/JNK蛋白的表達(dá)較NC組上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor后P-JNK/JNK蛋白的表達(dá)較NC組下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此我們?cè)趏x-LDL干預(yù)

11、的條件下再次檢測(cè)P-JNK/JNK蛋白的表達(dá)。在ox-LDL干預(yù)條件下，轉(zhuǎn)染miR-4463mimic組較NC組下調(diào)47％(P=0.0319)，轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor組上調(diào)68％(P=0.0209),并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在加入JNK通路的抑制劑SP600125干預(yù)轉(zhuǎn)染miR-4463inhibitor后的血管平滑肌細(xì)胞，在SP600125干預(yù)后能逆轉(zhuǎn)miR-4463inhibitor促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移的效應(yīng)和細(xì)胞骨架改變

12、的效應(yīng)。在SP600125抑制劑干預(yù)后的miR-4463inhibitor組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少60％(P=0.0021)，并能逆轉(zhuǎn)平滑肌細(xì)胞長(zhǎng)梭狀的變化，F(xiàn)-actin的熒光也明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：1.MiR-4463在ASO患者較對(duì)照人群血漿中的表達(dá)下調(diào)表明miR-4463可能參與ASO疾病的病理發(fā)生過(guò)程。2.MiR-4463在ox-LDL干預(yù)條件下的血管平滑肌細(xì)胞中較正常對(duì)照組的表達(dá)下調(diào)，提示miR-4463可能參與ASO疾