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文檔簡介
1、目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)被定義為一種慢性炎癥性血管疾病,其發(fā)生機(jī)制目前仍不完全清楚?;趯用}粥樣硬化發(fā)病原因的研究,其發(fā)病過程中主要是血管腔由脂質(zhì)堆積而變得狹窄,狹窄過程中有多種因素參與其中并發(fā)揮作用。如炎癥細(xì)胞及相關(guān)生長因子、脂質(zhì)循環(huán)與累積、血清與機(jī)械力刺激等。在這些因素作用下,首先導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,受損的內(nèi)皮會有趨化因子分泌,并在內(nèi)膜開始募集炎性因子。其次是單核細(xì)胞浸潤,活化巨噬細(xì)胞釋放炎性介
2、質(zhì),內(nèi)膜受到進(jìn)一步損傷,最后在內(nèi)膜層有血管平滑肌細(xì)胞移行和增殖的現(xiàn)象發(fā)生,造成管壁斑塊的形成。所以,血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)的增殖與遷移是斑塊形成與脫落并造成血栓的重要環(huán)節(jié),防止平滑肌細(xì)胞過度的增殖與遷移是阻斷AS發(fā)生的關(guān)鍵。
目前已有大量的研究結(jié)果表明,AS的發(fā)生機(jī)制主要是由于內(nèi)皮細(xì)胞的受損、脫落,致使血小板附著于損傷處,并伴有血小板衍生生長因子(Platelet-D
3、erived Growth Factor,PDGF)的釋放,刺激動脈的VSMC由原來所處的位置逐步向內(nèi)膜的移行、增生等。移行與增生的VSMC和大量沉積的脂質(zhì)共同導(dǎo)致了AS疾病的發(fā)生,因此VSMC在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可缺少的作用。然而VSMC的影響因素有很多,本文主要探究微小核糖核酸對其功能的影響。
微小核糖核酸(microRNA或miRNA)是一種非編碼的單鏈小RNA分子,在動植物的基因組中均有所表達(dá)。對miRNA的生
4、物學(xué)功能的研究與了解是不斷發(fā)展的,作為一種調(diào)節(jié)因子,主要參與到轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá),同時是一種負(fù)調(diào)控因子。其作用機(jī)制是具有選擇性的,可以直接對靶標(biāo)信使RNA降解,或者降低信使RNA的穩(wěn)定性,從而發(fā)揮其相應(yīng)的功能。近年來對于miRNA的研討有很多,心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展與miRNA的關(guān)系越來越密切。而miRNA-3568是近年新發(fā)現(xiàn)的一種單鏈小分子RNA,與心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系尚未見報道。本研究
5、主要探究miRNA-3568與動脈粥樣硬化尤其是對平滑肌細(xì)胞的作用及其相關(guān)機(jī)制,以期為干預(yù)AS的發(fā)生、發(fā)展及醫(yī)治提供新的思路。
方法:
1.利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-3568在大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)抑制和過表達(dá)。
2.運用實時定量PCR技術(shù)觀測A7r5細(xì)胞中miR-3568在PDGF-BB刺激下表達(dá)量的變化。
3. Western Blot法分析Akt、FoxO1、ERK蛋白表達(dá)的
6、變化。
4.采用MTT方法檢測miR-3568對A7r5細(xì)胞增殖的影響。
5.采用Boyden’s Chamber實驗觀察miR-3568對A7r5細(xì)胞遷移的影響。
6.采用Dual luciferase Report實驗驗證miR-3568的靶基因。
結(jié)果:
1.轉(zhuǎn)染Anti-miR-3568組能明顯抑制A7r5細(xì)胞中miR-3568的表達(dá)量。而轉(zhuǎn)染Pre-miR-3568能增加A7r
7、5細(xì)胞中miR-3568表達(dá)量。
2.實時定量PCR結(jié)果說明:在PDGF-BB刺激下,miR-3568在A7r5細(xì)胞中表達(dá)量降低。
3. Western Blot實驗結(jié)果表明:在 PDGF-BB刺激下,轉(zhuǎn)染 Anti-miR-3568對A7r5細(xì)胞的p-Akt、p-ERK和p-FoxO1表達(dá)量有上調(diào)作用。
4. MTT實驗表明:Anti-miR-3568具有促進(jìn)A7r5細(xì)胞增殖的作用。加入PI3K的抑制劑(
8、BEZ-235)后,細(xì)胞增殖作用受到抑制。但Pre-miR-3568對A7r5細(xì)胞的增殖沒有明顯的影響。
5. Boyden’s Chamber實驗表明:Anti-miR-3568具有促進(jìn)A7r5細(xì)胞遷移的作用。BEZ-235處理細(xì)胞后,細(xì)胞的遷移作用被抑制。但Pre-miR-3568對A7r5細(xì)胞遷移無明顯影響。
6. Dual luciferase Report實驗結(jié)果顯示:miR-3568與FoxO1沒有明顯的
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