木犀草素對血管平滑肌細胞增殖和遷移的抑制作用及機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：木犀草素對H202誘導(dǎo)大鼠主動脈平滑肌細胞增殖和遷移的抑制作用
　　 目的：以動脈粥樣硬化（AS）為發(fā)病基礎(chǔ)的心、腦血管疾病，已成為當今威脅人類健康的常見疾病之一，近年來，心血管病發(fā)病率與死亡率明顯增加，動脈粥樣硬化的治療和預(yù)防仍然是需要攻克的重點課題之一。AS是缺血性心血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS的發(fā)生是多種因素相互作用的結(jié)果，包括脂質(zhì)代謝異常、血流動力學(xué)負荷、感染和遺傳等。血管平滑肌細

2、胞(VSMCs)在AS等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。H202是活性氧(ROS)中最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，它既可以直接促進細胞增殖，也可以作為多種細胞外刺激因子的細胞內(nèi)第二信號對VSMC的增殖和遷移發(fā)揮重要作用。
　　 目前仍沒有直接針對AS治療的安全有效藥物。因而，選擇低毒、低廉、高效的抗VSMCs增殖和遷移的藥物日趨重要。本實驗選用過氧化氫(H202)誘導(dǎo)VSMCs增殖和遷移，旨在觀察木犀草素(Luteolin

3、)對大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)增殖和遷移的抑制作用，并對其作用機制進行初步探討。
　　 方法：
　　 (1)組織貼塊法培養(yǎng)大鼠大動脈平滑肌細胞(RASMCs)，建立RASMCs體外培養(yǎng)模型，在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細胞進行平滑肌α-肌動蛋白(SM-αactin)免疫組化鑒定，取3～5代細胞進行實驗。
　　 (2)實驗分為：正常對照組、H202組、Luteolin組、H202+Luteol

4、in濃度梯度組。
　　 (3)噻唑藍(MTT)比色法觀察細胞增殖情況，Transwell小室測定細胞遷移情況，免疫印跡實驗(Westem blot)測定p-Src，p-Akt(308)，p-Akt(473)，p-PDK1激酶活化情況，硝酸還原酶法測定NO含量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)原代培養(yǎng)的VSMCs生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。SMa-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞具有典型的VSMC

5、特征。
　　 (2) MTT結(jié)果顯示與對照組相比，H202能明顯促進VSMCs的增殖。與對照組相比，單用Luteolin使VSMCs數(shù)量明顯減少。H202促進VSMCs增殖的作用能被Luteolin所抑制，并且Luteolin呈濃度依賴性抑制VSMCs增殖，以50uM作用最為顯著。
　　 (3) Transwell小室結(jié)果顯示H202作用12小時可促進VSMCs遷移，Luteolin能明顯抑制VSMCs遷移，隨著Lute

6、olin濃度增加，細胞遷移數(shù)明顯減少，并呈劑量依賴性。
　　 (4) NO含量檢測結(jié)果顯示H202能夠抑制NO的釋放，而Luteolin可以促進NO的釋放，隨著濃度的增加，呈劑量依賴性對抗H202的抑制作用，但趨勢并不明顯，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (5) Westem blot結(jié)果顯示p-Akt在H202刺激后30 min活化水平最高，其后降低至本底水平，Luteolin可明顯降低Akt磷酸化水平。Luteolin對P

7、DKI的磷酸化水平亦有降低作用。
　　 (6) Westem blot結(jié)果顯示Luteolin能明顯抑制VSMCs中p-Src活化水平。Src活化在5min達到峰值，在30min中降低至本底水平。而Luteolin組Src的活性雖然5min時也有一些活化，但明顯低于H202刺激組。
　　 結(jié)論：
　　 (1) Luteolin呈濃度依賴性抑制H202誘導(dǎo)VSMCs的增殖和遷移。
　　 (2) Luteol

8、in對抗VSMCs的增殖和遷移是不通過NO信號分子發(fā)揮作用的。
　　 (3) Luteolin可通過抑制Akt信號通路來影響VSMCs的增殖和遷移。
　　 第二部分：木犀草素對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠主動脈平滑肌細胞增殖和遷移的抑制作用
　　 目的：動脈粥樣硬化(AS)及其相關(guān)疾病是嚴重危害人民健康的心血管病變。迄今為止，雖然對它們的發(fā)生過程基本上有了清楚的的認識，但對早期AS發(fā)生的分子機制尚不明了。在我國，心血管病發(fā)病

9、率與死亡率近年明顯增加。AS是缺血性心血管疾病的病理基礎(chǔ)。AS病因、病理復(fù)雜，是多種因素相互作用的結(jié)果，包括脂質(zhì)代謝異常、血流動力學(xué)負荷、感染和遺傳等。目前仍沒有直接針對AS治療的安全有效藥物。因而，抗早期AS藥物的研究和開發(fā)日益受到重視。
　　 本實驗旨在觀察木犀草素對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠胸主動脈平滑肌細胞增殖與遷移的抑制作用，并對其作用機制進行初步探討，研究木犀草素抗早期動脈粥樣硬化的機理，為今后Luteolin

10、作為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化性疾病提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)組織貼塊法培養(yǎng)RASMCs，建立RASMCs體外培養(yǎng)模型，在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細胞進行SM-α actin免疫組化鑒定，取3～5代細胞進行實驗。
　　 (2)實驗分為：正常對照組、AngⅡ組、Luteolin組、AngⅡ+Luteolin濃度梯度組。
　　 (3)噻唑藍(MTT)比色法觀察細胞增殖情況，T

11、ranswell小室測定細胞遷移情況，免疫印跡實驗(Westem blot)測定NOX1，p-Src，p-Akt308，p-Akt473，p-PDKI蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 (1)原代培養(yǎng)的VSMCs生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。SMa-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細胞具有典型的VSMC特征。
　　 (2) MTT結(jié)果顯示與對照組相比，AngⅡ能明顯促進VSMCs的增殖。與對照組相比，

12、單用Luteolin使VSMCs數(shù)量明顯減少。AngⅡ促進VSMCs增殖的作用能被Luteolin所抑制，并且Luteolin呈濃度依賴性抑制VSMCs增殖，以50uM作用最為顯著。
　　 (3) Transwell小室顯示細胞經(jīng)過AngⅡ刺激后，與對照組相比，遷移活性明顯增強，而加入Luteolin后能顯著抑制細胞遷移并呈劑量依賴性。
　　 (4) Westem blot結(jié)果顯示Luteolin可顯著抑制NOX1的蛋白

13、表達，并呈濃度依賴性。
　　 (5) Westem blot結(jié)果顯示給藥組p-Src蛋白表達明顯低于同時間點的AngⅡ組，Luteolin能顯著抑制p-Src的活化。
　　 (6) Westem blot結(jié)果顯示給藥組p-Akt308，p-Akt473，p-PDKI蛋白表達明顯低于同時間點的AngⅡ組，Luteolin可明顯降低Akt磷酸化水平。Luteolin對降低p-PDK1的活化水平亦有作用，但效果沒有p-Akt顯