紫草素對Hela細(xì)胞增殖抑制作用及血管平滑肌細(xì)胞保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　探討紫草素對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用及誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制和對血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)化療性損傷產(chǎn)生的預(yù)防性保護(hù)和治療作用及作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)兔血管平滑肌細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡觀察血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)，以硫酸長春新堿(VCR)建立化療性損傷模型;
　　2.MTT比色法測定紫草素不同濃度和不同作用時間對血管平滑肌細(xì)胞預(yù)防和治療化療性損傷的作用;
　　3.細(xì)胞乳

2、酸脫氫酶(LDH)和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定分析紫草素預(yù)防及治療血管平滑肌細(xì)胞化療損傷的作用機(jī)制;
　　4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析測定紫草素預(yù)防及治療血管平滑肌細(xì)胞化療損傷作用中的細(xì)胞周期和凋亡率。
　　5.體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡觀察Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;
　　6.MTT比色法測定紫草素不同濃度和不同作用時間對Hela細(xì)胞體外增殖的抑制作用;
　　7.通過測定caspase-3、-8、-9

3、的活力，研究細(xì)胞凋亡的途徑;
　　8.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析測定紫草素誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果:
　　1.光學(xué)顯微鏡下觀察血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)，未貼壁前細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)密度高，不透明，胞核多為卵圓形，有多個核仁;貼壁生長的細(xì)胞胞質(zhì)透明，呈長梭形、不規(guī)則形、放射性生長，成束的細(xì)胞平行排列，部分區(qū)域多層重疊，部分區(qū)域呈單層，高低起伏，符合血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)特征，呈現(xiàn)特征性的“峰-谷”狀生長。經(jīng)HE

4、染色，胞核藍(lán)染，胞質(zhì)紅染，證實(shí)為血管平滑肌細(xì)胞。經(jīng)α-SM-actin免疫熒光化學(xué)鑒定，胞漿著色，呈陽性反應(yīng)，高倍鏡下觀察，胞漿內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長軸平行的纖維細(xì)絲，即平滑肌α-肌動蛋白絲，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞。
　　2.MTT比色法檢測不同藥物濃度和作用時間對VSMC細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示化療藥物VCR(0.8μg·ml-1)對細(xì)胞的損傷＞60％，紫草素對VSMC具有保護(hù)和治療作用，其中5μg·ml-1(作用時間0.5、

5、1h)略優(yōu)于10μg·ml-1(作用時間0.5、1h)。
　　3.乳酸脫氫酶LDH活性測定結(jié)果顯示，預(yù)防組紫草素和紫草素+VCR的LDH活性測定結(jié)果分別為1349.2±107.7、1590.5±40.8，與化療藥物VCR組3004.8±129.0相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與空白對照組1398.4±64.0相比，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;治療組紫草素和VCR+紫草素的LDH活性測定結(jié)果分別為1351.0±31.4、1

6、966.7±93.0，與化療藥物VCR組3598.0±87.0相比，具有顯著性差異（P＜0.01），與空白對照組1529.4±40.2相比，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定以去甲腎上腺素(NE)和維拉帕米(VER)做陽性對照，結(jié)果顯示NE組熒光強(qiáng)度為703.2±32.0，與空白對照組261.7±24.6相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，VCR組熒光強(qiáng)度為1137.2±137.2，與空白對照組26

7、1.7±24.6相比，具有顯著性差異（P＜0.01），NE+VER組熒光強(qiáng)度為280.1±21.9，與NE組相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，NE+紫草素組熒光強(qiáng)度為311.9±26.1，與NE組相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，紫草素+VCR組熒光強(qiáng)度為290.3±62.8，與VCR組相比，具有顯著性差異（P＜0.01）。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析顯示紫草素可消除化療藥物VCR對細(xì)胞有絲分裂阻滯作用，使G2期細(xì)胞比例恢復(fù)正

8、常，單藥時可提高正常細(xì)胞S期比例。
　　5.光學(xué)顯微鏡下觀察紫草素對Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞固縮，胞體變圓，縮小，核染色質(zhì)致密濃縮，培養(yǎng)基液面漂浮死細(xì)胞
　　6.MTT比色法結(jié)果顯示，紫草素對Hela細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，且隨給藥濃度的升高及作用時間的延長，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性。
　　7.caspase-3、-8、-9的活力測定表明，不同濃度的紫草素作用于Hela細(xì)胞與對照組相比，caspa

9、se-3、-8、-9的活力明顯增高，且隨著紫草素劑量的增加，吸光度值也隨之增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，1、5、10μg·ml-1紫草組caspase-3吸光度值分別為0.284±0.002、0.313±0.006、0.372±0.005，與空白對照組0.213±0.006相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，15、20μg·ml-1紫草組caspase-3吸光度值分別為0.416±0.007、0.490±0.03，與空白對照組0.213±0.0

10、06相比，具有顯著性差異(P＜0.01);1、5μg·ml-1紫草組caspase-8吸光度值分別為0.349±0.004、0.402±0.003，與空白對照組0.213±0.006相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），10、15、20μg·ml-1紫草組caspase-8吸光度值分別為0.495±0.006、0.565±0.002、0.696±0.003，與空白對照組0.213±0.006相比，具有顯著性差異(P＜0.01);1、5μ

11、g·ml-1紫草組caspase-9吸光度值分別為0.384±0.002、0.472±0.007，與空白對照組0.213±0.006相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，10、15、20μg·ml-1紫草組caspase-9吸光度值分別為0.561±0.004、0.620±0.006、0.748±0.005，與空白對照組0.213±0.006相比，具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　8.流式細(xì)胞術(shù)分析顯示隨著紫草素濃度的增加，處

12、于S期的Hela細(xì)胞增多，而G1期的細(xì)胞減少，多數(shù)細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的S期。
　　結(jié)論:
　　1.紫草素對化療藥物VCR誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的損傷具有預(yù)防保護(hù)和修復(fù)作用，且以紫草素5μg·ml-1，作用0.5、1h效果佳;紫草素可逆轉(zhuǎn)化療藥物VCR引起的血管平滑肌細(xì)胞LDH的增加，進(jìn)而通過保護(hù)細(xì)胞膜的完整性而發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)細(xì)胞的作用;紫草素對損傷細(xì)胞的修復(fù)作用與細(xì)胞膜上Ca2+通道相關(guān)，對損傷藥物引起的Ca2+內(nèi)流有很強(qiáng)的阻

13、抑作用，同時加用鈣離子阻斷劑如維拉帕米也可阻止Ca2+內(nèi)流，起到保護(hù)作用;紫草素可消除化療藥物VCR對VSMC細(xì)胞有絲分裂阻滯作用，使G2期細(xì)胞比例恢復(fù)正常，預(yù)防用藥中單藥對細(xì)胞各周期無明顯影響，治療時S期細(xì)胞比例有明顯增加。
　　2.紫草素對Hela細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，且隨給藥濃度的升高及作用時間的延長，呈現(xiàn)時間-劑量依賴性;紫草素誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡可能與通過活化caspase-3、-8、-9相關(guān);紫草素使Hela細(xì)胞