構(gòu)建抑制NF-κB信號通路的藥物篩選模型.pdf

1、核因子kB(nuclear factor of kB,NF-kB)是20年前首先在成熟漿細胞中發(fā)現(xiàn),與免疫球蛋白K輕鏈基因的內(nèi)含子的增強子序列特異性結(jié)合,并促進基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合復(fù)合體,它廣泛存在于真核細胞中。通過調(diào)節(jié)靶基因的表達,NF-kB轉(zhuǎn)錄因子在多種細胞活動中起著重要作用,如細胞增殖,細胞死亡,發(fā)育以及先天、后天免疫反應(yīng)等,尤其在炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,被認為是預(yù)防和治療腫瘤與炎癥的理想靶點。因此,建立抑制NF-kB信號通路

2、的藥物篩選模型至關(guān)重要。
　　 生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展,使高通量藥物篩選成為可能,并于上世紀(jì)末發(fā)展起來,該項技術(shù)以隨機篩選為基礎(chǔ),可以對大量樣品進行篩選,成為主動尋找藥物的重要技術(shù)手段。高通量篩選技術(shù)以分子水平和細胞水平的實驗方法為手段,目前呈多元化發(fā)展趨勢,可在以下三種平臺上進行,即酵母平臺、細胞平臺和動物平臺。熒光素酶報告基因分析技術(shù)在藥物的高通量篩選中起著重要的作用。
　　 研究表明,TNFa在體內(nèi)和體外能很

3、好的激活NF-kB,可以作為NF-kB信號通路的陽性激活劑；IkBa能與NF-kB結(jié)合,定位于細胞質(zhì)內(nèi),阻止NF-kB入核、執(zhí)行其轉(zhuǎn)錄活性,因此檢測IkBa的降解與否可以間接反映NF-kB的活化狀態(tài)；藤磺酸（gambogic acid,GA）能夠抑制NF-kB的活性,可以作為NF-kB的陽性抑制劑。本文利用熒光素酶報告基因技術(shù)和蛋白印跡技術(shù)分別探索TNFa處理濃度和時間對NF-kB-luc報告基因表達和NF-kB抑制亞單位IkBa降解的

4、影響,進而構(gòu)建NF-kB信號通路抑制劑藥物篩選模型。
　　 在螢光素酶報告基因檢測篩選模型中,首先檢測了TNFa刺激293T細胞的最佳濃度:用不同濃度的TNFa（0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1nM）刺激293T細胞,然后選擇最佳TNFa濃度以不同的時間(O,3,6,12,18,24,36h)刺激293T細胞,檢測TNFa作用的最佳時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.01nM TNFa處理24 h即能刺激293T細胞中NF

5、-kB-luc報告基因較高水平的表達,且其表達量與TNFa的劑量和處理時間呈正相關(guān)性。藤黃酸驗證表明NF-kB螢光素酶報告基因檢測篩選體系穩(wěn)定可行。
　　 在NF-kB抑制亞單位降解篩選模型中,首先檢測了TNFa刺激Pane-28細胞最佳時間:用0.01 nMTNFa以不同的時間(O,5,15,30,60 min)刺激Pane-28細胞,然后選擇較好的時間以不同的TNFa濃度（O,0.01,0.05,0.1,0.5nM）刺激Pa