肺炎嗜衣原體熱休克蛋白經(jīng)ERK、NF-κB信號(hào)通路調(diào)控HUVEC分泌炎癥因子.pdf

1、研究背景：肺炎嗜衣原體（Cpn）是一類(lèi)重要的呼吸道病原體，造成全球約10％的社區(qū)獲得性肺炎及5%支氣管炎和竇炎病例的發(fā)生，還與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等多種慢性疾病相關(guān)。許多國(guó)家的人群Cpn感染率占全國(guó)人口的50%~70%，但人群感染該菌后多表現(xiàn)為持續(xù)的“隱蔽性”，患者病情易被忽視而導(dǎo)致Cpn感染反復(fù)遷延，造成機(jī)體不可逆的病理改變甚至嚴(yán)重并發(fā)癥。研究 Cpn的致病因素，闡明毒力相關(guān)蛋白的致病作用及機(jī)制對(duì)預(yù)防Cpn感染，控

2、制其傳播具有重要意義。
　　Cpn感染引起的炎癥反應(yīng)是多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。其中，Cpn熱休克蛋白（HSPs）在病原體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。為研究CHSPs在Cpn誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的功能及其相關(guān)受體及信號(hào)通路，進(jìn)一步說(shuō)明CHSPs在炎癥/免疫病理?yè)p傷中的作用及其可能的致病機(jī)制，擬運(yùn)用細(xì)胞微生物學(xué)分析Toll樣受體（TLR）2和TLR4、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路和核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路在介導(dǎo)CHSPs誘生宿主

3、細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。
　　研究目的：本研究試圖探討3種CHSPs在體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）分泌前炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β的功能，以及ERK信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路在CHSPs誘生炎癥因子過(guò)程中的作用，初步研究TLR2、TLR4與CHSPs誘生炎癥因子及其炎癥信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)進(jìn)一步闡明Cpn的致病機(jī)制具有重要意義。
　　研究方法：從 Genbank上獲得目的蛋白的全基因序列，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)

4、，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，從制備的Cpn基因組模板上PCR擴(kuò)增獲得目的基因全長(zhǎng)，經(jīng)雙酶切后與pGEX-6p-2載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化E. coliXL1-Blue構(gòu)建原核表達(dá)重組體。在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白，Western-blot鑒定蛋白，以GST·BindTM Resin或Ni-NTA親和層析純化目的蛋白，超濾管濃縮純化蛋白，并調(diào)整蛋白至1mg/mL的使用濃度。將該蛋白以polymyxin B

5、agarose處理，或加入50μg/mL多粘菌素B于37℃孵育30min~1h去除內(nèi)毒素。
　　培養(yǎng) HUVEC，將上述獲得的無(wú)內(nèi)毒素的純化蛋白分別以0.5、1、5、10、15、20、30μg/mL的不同濃度刺激細(xì)胞，檢測(cè)HUVEC分泌炎癥因子IL-1β、IL-6的水平；并設(shè)2、6、12、24、36、48、60h不同的蛋白刺激時(shí)間，檢測(cè)HUVEC分泌IL-1β、IL-6的水平；將純化產(chǎn)物經(jīng)熱處理（56℃，20min或100℃，30

6、min）或去蛋白處理后，再與細(xì)胞孵育以檢測(cè)刺激物對(duì)細(xì)胞分泌炎癥因子的影響。
　　將3種CHSPs按2、15、30、45、60min的不同時(shí)間作用宿主細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，并以抗磷酸化ERK及抗總ERK單抗檢測(cè)ERK通路的活化。設(shè)立LPS與Cpn陽(yáng)性對(duì)照，觀察比較 CHSPs與陽(yáng)性對(duì)照激活 ERK的方式；觀察比較3種CHSPs激活ERK的作用強(qiáng)弱；以ERK通路特異性抑制劑U0126預(yù)孵育細(xì)胞30min，CHSPs刺激后檢測(cè)ERK通路

7、的活化狀態(tài)及炎癥因子的水平。
　　將3種CHSPs按30min，60min，120min的作用時(shí)間孵育宿主細(xì)胞，收獲細(xì)胞核蛋白提取物，與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合進(jìn)行凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)，以PBS及GST蛋白為陰性對(duì)照，觀察比較3種CHSPs與陰性對(duì)照的結(jié)果，鑒定CHSPs是否能激活HUVEC誘導(dǎo) NF-κB分子活化、活化分子的作用特點(diǎn)以及活化作用的強(qiáng)弱；進(jìn)一步用特異性抗p65單抗進(jìn)行supershift實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證上述EM

8、SA實(shí)驗(yàn)核蛋白提取物中是否含有活化產(chǎn)物p65特異性抗原。以NF-κB通路特異性抑制劑PDTC預(yù)孵育細(xì)胞60min，CHSPs刺激后檢測(cè)NF-κB通路的活化狀態(tài)及炎癥因子的水平。以報(bào)告基因pNF-κB-luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并設(shè)pRL-TK內(nèi)參，進(jìn)一步證實(shí)CHSPs在刺激HUVEC后能否活化NF-κB分子進(jìn)入細(xì)胞核，并與靶基因上特定的κ位點(diǎn)結(jié)合以調(diào)節(jié)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。
　　以TLR2、TLR4、CD14、MD2分子根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不轉(zhuǎn)染或單獨(dú)或共

9、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（Human embryonic kidney cell）HEK293，用20μg/mL的CHSPs分別刺激，Western-blot檢測(cè)TLR2和/或TLR4在CHSPs激活ERK信號(hào)通路中的作用；同時(shí)，將這些分子按不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐cpNF-κB-luc與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TLR2和/或TLR4在CHSPs激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性中的作用。
　　研究結(jié)果：以Cpn標(biāo)準(zhǔn)株AR-39

10、基因組為模板擴(kuò)增得到Chsp60和Chsp70的基因全長(zhǎng)，并構(gòu)建了pGEX-6p-2的原核重組質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定為CHSP60及CHSP70蛋白的基因序列；重組質(zhì)粒在E.coli XL1-blue中誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約86kDa和98kDa的融合蛋白，且均以可溶性的方式存在，Western-blot檢測(cè)為GST標(biāo)記的目的蛋白。復(fù)蘇CHSP10重組菌并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。分別用GST·BindTM Resin及Ni-NTA親

11、和層析純化獲得高純度的目的蛋白，經(jīng)超濾裝置可將目的蛋白濃縮至原濃度的幾十倍，調(diào)整后使工作蛋白濃度為1mg/mL，經(jīng)多粘菌素B處理可去除內(nèi)毒素。
　　CHSPs刺激宿主細(xì)胞分泌前炎癥因子的作用根據(jù)不同的蛋白劑量及不同刺激時(shí)間有所不同。CHSPs刺激HUVEC分泌IL-1β、IL-6的水平隨蛋白濃度的升高而呈上升趨勢(shì)，在濃度為0.5~30μg/mL的范圍內(nèi)，以30μg/mL的CHSPs誘生細(xì)胞分泌的炎癥因子水平最高；在2~60h的作用

12、時(shí)間內(nèi)，隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，誘生炎癥因子的水平逐漸升高，CHSP10在刺激12h后誘生IL-1β、IL-6的量到達(dá)高峰，而CHSP60和CHSP70在刺激24h后誘生IL-1β、IL-6的量到達(dá)高峰，3種CHSPs相比，CHSP60誘生炎癥因子的能力最強(qiáng)，CHSP70次之，CHSP10最弱。
　　3種CHSPs刺激HUVEC后，Western-blot能檢測(cè)到明顯增強(qiáng)的磷酸化ERK分子，CHSP10在刺激15min時(shí)就可出現(xiàn)明顯的磷

13、酸化蛋白條帶，經(jīng) bandscan掃描分析，其在30min磷酸化ERK達(dá)到峰值；CHSP60和CHSP70均在刺激30min時(shí)磷酸化ERK條帶出現(xiàn)高峰值，隨后逐漸降低；Cpn激活HUVEC的ERK通路也是在30min時(shí)達(dá)到峰值，其后下降。而LPS活化HUVEC的ERK通路則是在15min達(dá)到峰值。三種CHSPs相比，CHP60活化ERK通路的作用最強(qiáng)，20μg/mL濃度產(chǎn)生的效果僅比Cpn（MOI=0.5）的作用稍弱，CHSP10與CH

14、SP70作用次之。用U0126預(yù)孵育后，Western-blot檢測(cè)到每組磷酸化 ERK的量顯著降低，同時(shí)CHSPs刺激HUVEC分泌2種炎癥因子的水平也明顯減少。
　　3種CHSPs刺激HUVEC后，EMSA顯示，實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)蛋白與DNA結(jié)合的復(fù)合物遷移帶，且在30min，60min，120min的不同時(shí)間點(diǎn)，以蛋白作用60min時(shí)濃度最深，與陰性對(duì)照組相比有明顯區(qū)別；3組CHSPs相比，CHSP60的作用最強(qiáng)，20μg/mL濃

15、度產(chǎn)生的效果與Cpn（MOI=0.5）的作用相當(dāng)，CHSP70作用次之，CHSP10最弱。Supershift實(shí)驗(yàn)顯示3組 CHSPs中除了特異性蛋白/DNA復(fù)合物遷移帶外，均出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體復(fù)合物超遷移帶。用PDTC預(yù)孵育細(xì)胞后，EMSA顯示蛋白/DNA復(fù)合物遷移帶明顯減弱甚至消失，同時(shí)，CHSPs刺激HUVEC分泌的IL-1β、IL-6的水平也明顯減少。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，CHSPs可活化HUVEC的NF-κB分子。<

16、br>　　以人 TLR2、TLR4和 CD14及 MD2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞后，Western-blot顯示轉(zhuǎn)染TLR2和/或TLR4后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)CHSPs刺激后均可顯著上調(diào)磷酸化ERK的表達(dá)；以共轉(zhuǎn)染pNF-κB-luc、pRL-TK質(zhì)粒的報(bào)告基因來(lái)檢測(cè)TLR在介導(dǎo)NF-κB通路中的作用，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了TLR的實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)刺激后可顯著激活NF-κB信號(hào)通路，其中，共轉(zhuǎn)染2種受體的實(shí)驗(yàn)組通路活化的程度要高于單項(xiàng)轉(zhuǎn)染組，在單

17、項(xiàng)轉(zhuǎn)染組中，以 TLR4介導(dǎo)激活 NF-κB活化的作用強(qiáng)于TLR2。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了CHSP10、CHSP60、CHSP70的原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及純化后獲得了1mg/mL高純度的相對(duì)分子量分別為15kDa、86kDa、98kDa的可溶性純化蛋白；
　　2. CHSPs能在體外刺激 HUVEC分泌炎癥因子 IL-1β、IL-6，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性與時(shí)間依賴(lài)性，說(shuō)明CHSPs可能參與Cpn誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)