LncRNA Gm4419通過NF-kappaB-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路調(diào)控糖尿病腎病炎癥的分子機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為終末期腎病的主要原因，是糖尿病的常見并發(fā)癥之一。近年來，研究證據(jù)表明核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活和含有熱蛋白結(jié)構(gòu)域的甘氨酸結(jié)合及寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體3炎癥因子(NACHT,LRR and PYD domain-containing protein3,NLRP3炎癥小體)在糖尿病腎病的炎癥進(jìn)展過程密切相關(guān)。然而，它們的

2、機(jī)體作用機(jī)制尚不清楚。近年來研究顯示，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)異常表達(dá)在糖尿病腎病等多種疾病中扮演著重要角色。然而，lncRNA在糖尿病腎病的炎癥過程中的功能和作用機(jī)制仍未揭開神秘面紗。
　　在我們課題組前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA sequencing,RNA-seq)和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time fluorescent quantitative PCR

3、,qRT-PCR)在糖尿病腎病db/db小鼠腎臟組織中鑒別了14個(gè)呈異常表達(dá)的lncRNAs。在目前的實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步通過qRT-PCR檢測(cè)這14個(gè)糖尿病腎病相關(guān)的 lncRNAs在高、低糖條件下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其中12個(gè)lncRNA在腎臟組織和系膜細(xì)胞中的表達(dá)趨勢(shì)一致。我們通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在這12個(gè)異常表達(dá)的lncRNAs中，只有上調(diào)差異倍數(shù)最大的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA Gm4419與糖尿病腎病炎

4、癥相關(guān)的NF-κB亞基p65和p50存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)。此外，沉默Gm4419能夠明顯抑制高糖條件下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞促炎癥因子、腎臟纖維標(biāo)記蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖。然而過表達(dá)Gm4419能夠促進(jìn)低糖條件下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞的系膜細(xì)胞的促炎癥因子、腎臟纖維標(biāo)記蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖。更有趣的是，Gm4419通過直接與NF-κB的亞基p50相互作用激活NF-κB通路。另外，我們發(fā)現(xiàn)在系膜細(xì)胞中p50能直接作用于NLRP3炎癥小體。因此，我們用以下實(shí)

5、驗(yàn)展示，lincRNA Gm4419可能通過NF-κB/NLRP3炎癥小體信號(hào)通路參與高糖條件下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞炎癥、纖維化和增殖，這可能為Gm4419在糖尿病腎病的進(jìn)展過程中的調(diào)控機(jī)制提供新視角。
　　第一部分 Gm4419在小鼠腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)、分布及對(duì)系膜細(xì)胞炎癥、纖維化和增殖的影響
　　目的：
　　檢測(cè)高、低糖培養(yǎng)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中G m4419的表達(dá)、分布以及G m4419對(duì)高、低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞炎癥

6、、纖維化和增殖的影響，初步探討Gm4419與糖尿病腎病的關(guān)系。
　　方法：
　　通過qRT-PCR檢測(cè)14個(gè)糖尿病腎病相關(guān)的lncRNAs在高、低糖條件下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中的表達(dá)情況，并從中選取上調(diào)差異倍數(shù)最大，且生物信息學(xué)預(yù)測(cè)唯一與糖尿病腎病炎癥相關(guān)的NF-κB有綁定位點(diǎn)的lncRNA Gm4419為研究對(duì)象。FISH和qRT-PCR檢測(cè)Gm4419在系膜細(xì)胞中的定位；構(gòu)建 pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒，同

7、時(shí)設(shè)計(jì)合成 Gm4419 siRNA，并將pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒和Gm4419 siRNA分別轉(zhuǎn)染至低、高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)促炎癥因子和腎臟纖維標(biāo)記蛋白的mRNA表達(dá)水平；western blot和免疫熒光檢測(cè)促炎癥因子和腎臟纖維標(biāo)記蛋白的蛋白表達(dá)水平情況；EdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：
　　Gm4419在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)水平較L-M

8、C組顯著增高(P＜0.01)。將酶切和測(cè)序結(jié)果證實(shí)構(gòu)建成功的pcDNA3.1(+)-Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至L-MC組細(xì)胞，與L-MC mock組或L-MC pcDNA3.1組相比，L-MC Gm4419(+)組細(xì)胞炎癥因子、纖維化標(biāo)記蛋白表達(dá)水平增高以及增殖能力增強(qiáng)((P＜0.05)。此外，qRT-PCR篩選出一條最佳干擾Gm4419的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，轉(zhuǎn)染H-MC組后，與H-

9、MC mock組或H-MC siNC比較，H-MC Gm4419 siRNA組細(xì)胞炎癥因子、纖維化標(biāo)記蛋白表達(dá)水平增高以及增殖能力減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　lncRNA-Gm4419參與糖尿病腎病小鼠腎小球系膜炎癥、增生和纖維化的調(diào)節(jié)。
　　第二部分 Gm4419通過NF-κB/NLRP3炎癥小體信號(hào)通路調(diào)控腎小球系膜細(xì)胞中促炎癥因子的表達(dá)
　　目的：
　　探討調(diào)節(jié)Gm4419的表達(dá)對(duì)NF-κ

10、B/NLRP3炎癥小體信號(hào)途徑激活的調(diào)控及對(duì)下游促炎癥因子、纖維標(biāo)記蛋白和系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：
　　通過qRT-PCR檢測(cè)小鼠腎小球系膜細(xì)胞在低糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)NF-κB亞基p50和p65的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響；通過 qRT-PCR檢測(cè)小鼠腎小球系膜細(xì)胞在高糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419 siRNA對(duì)NF-κB亞基p50和p65的mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響；通過western blot檢測(cè)小鼠

11、系膜細(xì)胞在低糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκBα、IκBα、p50和p65相對(duì)表達(dá)水平的影響；通過western blot檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞在高糖條件下轉(zhuǎn)染Gm4419 siRNA對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子關(guān)鍵蛋白p-IκB、IκB、p50和p65相對(duì)表達(dá)水平的影響；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)定位小鼠系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Gm4419過表達(dá)質(zhì)粒和Gm4419 siRNA對(duì)p50和p65進(jìn)入細(xì)胞核情況的影響；通過ChIP檢測(cè)調(diào)

12、節(jié)Gm4419的表達(dá)對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動(dòng)子結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄的影響；通過qRT-PCR和FISH檢測(cè)調(diào)節(jié)p50的表達(dá)對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中Gm4419表達(dá)的影響；通過qRT-PCR、western blot、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)和FISH檢測(cè)同時(shí)過表達(dá)或同時(shí)沉默Gm4419和p50對(duì)Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平的影響；通過qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)Gm4419或p50對(duì)NLRP3炎癥小體m

13、RNA表達(dá)的影響；通過qRT-PCR檢測(cè)沉默Gm4419或p50對(duì)NLRP3炎癥小體 mRNA表達(dá)的影響；通過western blot和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè)調(diào)節(jié)Gm4419或p50的表達(dá)對(duì)NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)的影響；通過免疫沉淀檢測(cè) p50抗體能否沉淀內(nèi)源性NLRP3炎癥小體蛋白；通過細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測(cè) p50與內(nèi)源性NLRP3炎癥小體之間的共定位情況；通過western blot檢測(cè)SN50特異性阻斷p50或(和)JSH-23

14、特異性阻斷p65的活性后，調(diào)節(jié)Gm4419的表達(dá)對(duì) NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的蛋白表達(dá)的影響；通過western blot檢測(cè)在過表達(dá)Gm4419，并同時(shí)阻斷p65的活性后Gm4419對(duì)NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　QRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)Gm4419可以促進(jìn)p50和p65 mRNA表達(dá)(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制p50和p65 mRNA表達(dá)(P＜0.01)

15、；western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)Gm4419可以促進(jìn)IκB磷酸化形成p-IκB并降解從而引起細(xì)胞核內(nèi)p50和p65相對(duì)表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制IκB磷酸化形成p-IκB并降解從而引起細(xì)胞核內(nèi)p50和p65相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)顯示，過表達(dá)Gm4419可以促進(jìn)p50和p65蛋白向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，而沉默Gm4419可以抑制p50和p65蛋白向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移；ChIP檢測(cè)結(jié)

16、果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Gm4419可以促進(jìn) p50而非p65蛋白與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動(dòng)子結(jié)合并促進(jìn)它們轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)，而沉默Gm4419可以抑制p50而非p65蛋白與Gm4419和NLRP3炎癥小體啟動(dòng)子結(jié)合并抑制它們轉(zhuǎn)錄(P＜0.01)；qRT-PCR和FISH結(jié)果顯示，過表達(dá)p50可以促進(jìn)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Gm4419表達(dá)，而沉默p50可以抑制細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Gm4419表達(dá)；qRT-PCR、western blot細(xì)胞免

17、疫熒光化學(xué)和 FISH結(jié)果顯示，同時(shí)過表達(dá) Gm4419和 p50可以促進(jìn)Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平顯著升高，而沉默Gm4419和p50可以抑制Gm4419和p50的mRNA水平以及p50的蛋白水平顯著降低；qRT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)Gm4419或p50可以促進(jìn)NLRP3炎癥小體 mRNA表達(dá)，而沉默 Gm4419或 p50可以抑制NLRP3炎癥小體mRNA表達(dá)；western blot和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)

18、結(jié)果顯示，過表達(dá)Gm4419或p50可以促進(jìn)NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)，而沉默Gm4419或p50可以抑制NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)；免疫沉淀結(jié)果顯示，p50抗體能夠沉淀內(nèi)源性NLRP3炎癥小體；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)顯示p50與內(nèi)源性NLRP3炎癥小體在系膜細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象；western blot結(jié)果顯示，在低糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中過表達(dá)Gm4419，加入p50的特異性活性阻斷劑SN50或同時(shí)加入SN50和p65的特異性活性阻斷劑JSH-