補(bǔ)中益氣湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸道NLRP3炎性體活性的調(diào)控研究.pdf

1、目的:近幾年，NOD樣受體被發(fā)現(xiàn)，NLR家族的典型代表NLRP3也得到深入研究，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體在維持腸道穩(wěn)態(tài)及腸道炎癥發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，NLRP3廣泛表達(dá)于胃腸粘膜的上皮細(xì)胞中，在T、B淋巴細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，能被各種類(lèi)型的分子、細(xì)菌或病毒所激活，形成炎性體。腸上皮內(nèi)NLRP3一旦監(jiān)測(cè)到病原體或危險(xiǎn)信號(hào)，便在胞內(nèi)經(jīng)過(guò)招募ASC分子，激活caspase-1，“組裝”形成一種大分子蛋白復(fù)合體——inflammasome（炎

2、性體），進(jìn)而激活細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細(xì)胞因子，參與胞內(nèi)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)。因此，研究NLRP3炎性體活化通路在UC急慢性病理演變中的變化規(guī)律，對(duì)于探討UC結(jié)腸粘膜急慢性炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要作用。
　　按照中醫(yī)觀點(diǎn)“虛則補(bǔ)之，實(shí)則瀉之”，“脾虛失健”是UC發(fā)病的根本病機(jī)，故益氣健脾為UC的基本治法。補(bǔ)中益氣湯是益氣健脾法的代表復(fù)方，具有補(bǔ)氣健脾、提升中氣的功效。本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)中益氣湯

3、治療小鼠UC，觀察NLRP3炎性體及其下游信號(hào)通路細(xì)胞因子的表達(dá)，以探討補(bǔ)中益氣湯防治UC的效應(yīng)機(jī)制是否與調(diào)控腸道NLRP3炎性體活化通路有關(guān)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床，為臨床應(yīng)用益氣健脾治法提供科學(xué)依據(jù)。內(nèi)容:
　　1.C57BL/6小鼠UC模型的建立及補(bǔ)中益氣湯的作用
　　潰瘍性結(jié)腸炎是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重為主要癥狀，反復(fù)發(fā)作，急慢性交替出現(xiàn)的腸道炎癥疾病。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立UC急慢性動(dòng)物模型，觀察小鼠全身癥狀變化、腸道

4、變化（結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸重量）、病理性改變及炎癥性評(píng)分，評(píng)估該動(dòng)物模型及補(bǔ)中益氣湯對(duì)UC小鼠的治療作用。
　　方法:
　　128只SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組（32只）、模型對(duì)照組（32只）、補(bǔ)中益氣湯高劑量組（16只）、補(bǔ)中益氣湯中劑量組（16只）、補(bǔ)中益氣湯低劑量(16只)、陽(yáng)性藥柳氮磺吡啶片對(duì)照組（16只），除正常組外其余各組采用3％DSS（分子量36000-50000單位）飲水1周造成結(jié)腸損傷，再恢復(fù)正常飲水

5、3周，在3周、4周每天給予補(bǔ)中益氣湯高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥柳氮磺吡啶片對(duì)照組小鼠相應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)，分別于第1、2、3、4周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察:小鼠糞便性狀改變;結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸重量變化;結(jié)腸病理變化;結(jié)腸黏膜炎癥評(píng)分。
　　結(jié)果:
　　與正常組相比，模型組結(jié)腸重量增加（P＜0.05），結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.01），結(jié)腸黏膜炎癥評(píng)分明顯增高（P＜0.01）;造模2周后，結(jié)腸重量增加（P＜0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度減少（P＜

6、0.01），結(jié)腸黏膜炎癥評(píng)分增高（P＜0.01），造模后3、4周，結(jié)腸重量增加（P＜0.01），結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（P＜0.01），黏膜炎癥評(píng)分與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.補(bǔ)中益氣湯對(duì)UC小鼠結(jié)腸粘膜NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)的作用
　　NLRP3廣泛地表達(dá)于胃腸粘膜的上皮細(xì)胞，并且在粒細(xì)胞及T、B細(xì)胞也有表達(dá)。NLRP3位于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠的模式識(shí)別受體(Pattern reco

7、gnition receptor PRR)，是胞質(zhì)內(nèi)感受外源性微生物或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的監(jiān)測(cè)器，能被各種類(lèi)型的分子、細(xì)菌或病毒所激活，通過(guò)形成炎性體，參與腸道免疫和炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)機(jī)體固有免疫，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、保持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。NLRP3炎性體由NLRP3支架、ASC和caspase-1三部分組成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)補(bǔ)中益氣湯治療UC小鼠，觀察該復(fù)方藥對(duì)小鼠腸道NLRP3炎性體活化的調(diào)控作用。
　　方法:
　　采用實(shí)時(shí)熒光定量

8、PCR(real time PCR)檢測(cè)1、2、3、4周正常組與模型組、補(bǔ)中益氣湯高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥柳氮磺吡啶片對(duì)照組結(jié)腸粘膜NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA的表達(dá)。并用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果:
　　1、2、3、4周模型組結(jié)腸粘膜中NLRP3 mRNA表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.05，P1=0.039; P2=0.031; P3=0.036;P4=0.044）;緩解期，模型組與其余

9、各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;1、2、3、4周模型組結(jié)腸粘膜中ASC mRNA表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.05，P＜0.01，P1=0.039; P2=0.000; P3=0.002;P4=0.019）;緩解期，模型組與其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;1、2、3、4周模型組結(jié)腸粘膜中caspase-1mRNA表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增高（P＜0.05，P＜0.01，P1=0; P2=0.003;P3=0.028;P4=0.0

10、45）;緩解期，模型組與其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但補(bǔ)中益氣湯高中低劑量組caspase-1 mRNA表達(dá)較模型組有下降的趨勢(shì)。
　　3.補(bǔ)中益氣湯對(duì)UC小鼠結(jié)腸粘膜及血漿細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-33的作用
　　激活的NLRP3炎性體可將無(wú)活性的pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為活性的caspase-1，Caspases-1通過(guò)對(duì)pro(IL)-1β、pro-IL-18、pro-IL-33進(jìn)行剪切、加

11、工，使之轉(zhuǎn)化成有生物活性的細(xì)胞因子。以形成活性形式并分泌及執(zhí)行一系列細(xì)胞程序，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡。IL-1β、IL-18、IL-33是重要的促炎反應(yīng)介質(zhì)，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血漿及結(jié)腸粘膜細(xì)胞因子中IL-1β、IL-18、IL-33的含量，觀察補(bǔ)中益氣湯對(duì)NLRP3炎性體下游信號(hào)分子的調(diào)控作用。
　　方法:
　　每周結(jié)束后，取出不同組小鼠饑餓處理24小時(shí)，脫頸椎處死小

12、鼠，剖開(kāi)腹部，剪取整段結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，沿縱軸剪開(kāi)，用自來(lái)水清洗兩遍，再用預(yù)冷的生理鹽水清洗，在濾紙上吸去水分，稱(chēng)取凈重。并轉(zhuǎn)入勻漿器中加入10×PBS勻漿液充分勻漿，5000xg，4℃離心5min，取上清液用于檢測(cè)。采用眼球摘除方法收集小鼠血液，血液收集到預(yù)先準(zhǔn)備好的EDTA抗凝劑試管，標(biāo)本采集后30min內(nèi)于4℃1000xg離心15min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。用ELISA方法檢測(cè)腸道粘膜及血漿中IL-1β、IL-18、IL

13、-33的含量。并用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果:
　　炎癥急性期，UC小鼠血漿及結(jié)腸粘膜中IL-1β含量增加，明顯高于正常組（P＜0.05，P＜0.01，P結(jié)腸=0.033，P血漿=0.002），緩解期，IL-1β含量下降，與正常組比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）;造模后1、2、3周內(nèi)，小鼠結(jié)腸粘膜IL-18表達(dá)水平較正常組均顯著升高（P＜0.05 P1=0.035，P2=0.018，P3=0.002），造模3周后

14、，補(bǔ)中益氣湯高中低劑量組IL-18在結(jié)腸粘膜的表達(dá)量比模型組顯著下降，（P＜0.05）;模型組小鼠血漿IL-18含量均較空白組顯著增高，（P＜0.05，P1=0.027，P2=0.029，P3=0.017，P4=0.018，P5=0.045，P6=0.032），3、4周補(bǔ)中益氣湯高中低劑量組小鼠血漿中IL-18含量較模型組有下降趨勢(shì)，以補(bǔ)中益氣湯中劑量組最為明顯(P＜0.05);造模1周，模型組結(jié)腸粘膜IL-33的表達(dá)顯著高于正常組（P

15、＜0.01，P=0.004），2、3、4周，模型組與其余各組沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），補(bǔ)中益氣湯高中劑量組小鼠粘膜IL-33含量較模型組升高;1周血漿中IL-33含量較正常組明顯增高（P＜0.05，P=0.033），2、3、4周UC小鼠血漿IL-33水平接近正常組血漿IL-33水平，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　小鼠UC模型指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果在一定程度上體現(xiàn)了DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型從急性到慢性的病理變