機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷中NLRP3蛋白與線粒體功能的變化.pdf

1、研究目的:
　　機(jī)械相關(guān)性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）是一種在應(yīng)用呼吸機(jī)過程中由于機(jī)械張力的各種因素作用于肺組織引起的以肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡腔充血出血為病理特征的綜合征，臨床多表現(xiàn)為肺水腫及呼吸功能障礙。非生理性牽張除了通過機(jī)械剪切力破壞血?dú)夤δ芷琳?，使?xì)胞膜通透性增加之外，還能激活體內(nèi)的炎癥信號通路，導(dǎo)致白細(xì)胞和各種促炎因子在損傷部位聚集，導(dǎo)致肺部產(chǎn)生炎癥應(yīng)答，啟動和加重肺組織損

2、傷。在機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)中NLRP3炎性蛋白及炎性體也發(fā)揮著重要功能，其中NLRP3蛋白能夠通過Toll樣受體4(TollLike Receptor4，TLR4)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄信號發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯，生成增加并使炎性體聚合，最終通過蛋白水解作用將無活性的炎性因子前體pro-IL-1β轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒齑傺滓蜃覫L-1β并釋放至細(xì)胞外，引起機(jī)體的炎癥損傷，在NLRP3蛋白活化過程中線粒體來源的活性氧族(Reactive Oxygen Species

3、，ROS)起到了扳機(jī)作用，線粒體功能受損會導(dǎo)致線粒體膜電位（Mitochondria Membrane Potential，MMP）水平降低，發(fā)生ATP生成障礙、ROS異常生成增加等一系列后果，這些后果均會引起并加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。因此，本研究通過體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)來研究NLRP3蛋白與線粒體功能在VILI發(fā)生發(fā)展過程中的變化。
　　研究方法:
　　體內(nèi)試驗(yàn):SPF級C57BL/6小鼠30只，8-10周齡，體重20-

4、25g，雌雄各半，隨機(jī)分配成3組(n=10):對照組（Conrol，C組），機(jī)械通氣組(MechanicalVentilation，MV組)，機(jī)械通氣+TLR4阻斷劑組(Mechanical Ventilation+TAK-242，MV+T組)。對C組小鼠做氣管切開后不進(jìn)行氣管插管，自由通氣;MV組、MV+T組行機(jī)械通氣，RR=70次/min，VT=15ml/kg， I∶E）=1∶2，吸入氧濃度為21％，通氣時間為4h。MV+T組在麻醉

5、前用TLR4阻斷劑TAK-242(3mg/kg）預(yù)處理1h。機(jī)械通氣結(jié)束后，剪下右上肺放入EP管中，盡快使用液氮將其冷凍備用，后續(xù)蛋白免疫印跡法測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65);右肺下葉在4％多聚甲醛中固定48h后，進(jìn)行HE染色;止血鉗鉗夾左側(cè)肺根，使用1ml注射器抽取預(yù)冷在4℃冰箱中的生理鹽水緩慢注入對肺組織，充分灌洗肺組織3次，0.3ml/次，并將灌洗液(BALF)注入凍存管中，盡快

6、放入-80℃保存，BALF用于檢測BALF中炎性因子IL-1β濃度。
　　體外試驗(yàn):單層培養(yǎng)MLE—12細(xì)胞，隨機(jī)分為4組:對照組（C組）、20％牽張組（CS組）、20％+TLR4阻斷劑組（CS+T組）以及線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)劑cccp組（cccp組），CS組與CS+T組使用細(xì)胞牽張儀進(jìn)行循環(huán)性牽拉，牽張儀參數(shù)設(shè)置為:0.5 Hz，牽張和放松的時間比:1∶1，牽張時間均為4小時，其中CS+T組行牽張前1h用TLR4阻斷劑TAK-

7、242(1uM)進(jìn)行預(yù)處理。cccp組在后續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前30min用線粒體呼吸鏈解偶聯(lián)劑cccp(10uM)進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理及機(jī)械牽張結(jié)束后，每組留取等量細(xì)胞上清液置于凍存管迅速保存-80℃冰箱，用于檢測細(xì)胞上清液IL-1β濃度;提前準(zhǔn)備好冰袋，每組3孔細(xì)胞置于冰上提取蛋白總量，用于Western Blotting測NLRP3蛋白及NFκB-P65和磷酸化的NFκB-P65(NFκB-pP65)表達(dá)量;剩余細(xì)胞用JC-1法按照說明書處理

8、后用流式細(xì)胞儀檢測PE-A通道（紅）、FITV-A通道（綠）平均熒光強(qiáng)度和線粒體來源的ROS生成量。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1、HE染色發(fā)現(xiàn):大潮氣量機(jī)械通氣后小鼠肺泡細(xì)胞連接斷裂、肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)充血出血，伴隨肺泡腔內(nèi)透明膜形成。使用TLR4阻斷劑后行大潮氣量機(jī)械通氣組肺泡腔內(nèi)充血、出血減少，肺泡壁斷裂、增厚均減少。
　　2、western blotting發(fā)現(xiàn)，與C組和MV+T組相比MV組NLR

9、P3蛋白和磷酸化的NFκ3-P65表達(dá)均增加，其中MV+T組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-P65表達(dá)較C組增加，但較MV組減少。
　　3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)發(fā)現(xiàn)，與C組IL-1β濃度相比，MV組和MV+T組炎性因子表達(dá)量顯著增加(P＜0.05)，其中MV+T組IL-1β濃度較MV組降低。
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1、western blotting發(fā)現(xiàn)，與C組相比，其余三組NLRP3蛋白和磷酸化的NFκB-

10、P65表達(dá)量均顯著增加，CS+T組NLRP3蛋白和NFκB-pP65表達(dá)量均降低，cccp組與CS組蛋白表達(dá)量無明顯差異。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與C組相比，CS組、CS+T組和cccp組細(xì)胞MMP顯著下降，與CS組相比cccp組MMP水平無顯著差異，加入TLR4阻斷劑后行機(jī)械牽張，細(xì)胞MMP水平較CS組提高。
　　3、ELISA發(fā)現(xiàn)，IL-1β濃度在C組較其余三組低，與CS組相比，cccp組IL-1β濃度無明顯變化，