TIM-3在膿毒血癥中的免疫調(diào)節(jié)及其機制研究.pdf

1、背景:T細胞免疫球蛋白粘附分子-3(T cell Ig and mucin domain protein3,Tim-3)最初被發(fā)現(xiàn)于活化的Th1、Th17、Tc1效應(yīng)細胞上,與其天然配體半乳糖結(jié)合蛋白-9(Galectin-9,Gal-9)結(jié)合后可誘導(dǎo)T效應(yīng)細胞的凋亡,下調(diào)免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受。然而隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達在DC、巨噬細胞等天然免疫細胞上,并參與天然免疫的調(diào)節(jié)。由于Tim-3在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中

2、均具有重要的作用,所以它的表達失調(diào)與很多臨床疾病相關(guān)。Tim-3的低表達與T細胞功能增強的自身免疫性疾病有關(guān),如多發(fā)性硬化和自身免疫性肝炎;Tim-3的過表達與T細胞功能喪失相關(guān)的疾病有關(guān),如腫瘤或慢性細菌性感染。膿毒血癥是由感染誘發(fā)的全身性過度炎癥反應(yīng)。據(jù)統(tǒng)計全球每年有1800萬人發(fā)病,在非休克患者中,其死亡率為30％—40%,而在休克患者中其死亡率則高達70%—90%。即便在發(fā)達國家如美國,一年就有近25萬膿毒血癥死亡病例。膿毒血癥

3、發(fā)病率仍存在上升的趨勢,但目前尚缺乏有效的診治手段。另外有越來越多的數(shù)據(jù)顯示,參與天然免疫反應(yīng)的Tim-3具有免疫自穩(wěn)調(diào)節(jié)的功能。Tim-3是否能夠促進膿毒血癥的免疫自穩(wěn),成為治療膿毒血癥的新措施,目前還不清楚。
　　目的:Tim-3在天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起非常重要的免疫調(diào)節(jié)作用,探究該分子在膿毒血癥中的可能免疫調(diào)節(jié)作用及其機制。
　　方法:
　　1、收集膿毒血癥患者血標本,觀察不同病情患者Tim-3表達情況;構(gòu)

4、建經(jīng)典膿毒血癥動物模型—盲腸結(jié)扎穿刺術(shù),觀察模型發(fā)病過程中Tim-3的動態(tài)變化;給予Tim-3單抗或者Tim-3融合蛋白,觀察Tim-3通路阻斷后,CLP生存率和脾臟細胞因子變化情況。
　　2、觀察Tim-3單抗對CLP腹腔巨噬表達細胞細胞因子的影響;觀察CLP不同嚴重程度時,腹腔巨噬細胞表達Tim-3情況;觀察穩(wěn)定低/高表達Tim-3 RAW264.7細胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應(yīng)性。
　　3、檢測RAW264

5、.7細胞系/小鼠腹腔巨噬細胞受到不同濃度LPS或不同時間點LPS刺激后,Tim-3表達情況;Tim-3單抗對LPS模型脾臟細胞因子的影響;Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細胞因子影響。
　　結(jié)果:
　　1、與輕度膿毒血癥患者相比,重癥患者外周血中表達Tim-3下降;CLP模型隨著時間的延長,Tim-3表達呈先升高后下降的趨勢,并且與sham相比,CLP小鼠Tim-3表達下降;給予Tim-3單抗或者Tim-

6、3融合蛋白,Tim-3通路阻斷,CLP生存率下降,脾臟細胞因子(IL-1β、IL-6、TLR4等)均呈現(xiàn)上升趨勢。
　　2、Tim-3單抗阻斷CLP體內(nèi)Tim-3通路后, CLP腹腔巨噬表達細胞細胞因子呈升高趨勢;與sham相比, CLP小鼠腹腔巨噬細胞表達Tim-3下降;觀察穩(wěn)定低/高表達Tim-3 RAW264.7細胞系的吞噬能力及其對TLRs激動劑的反應(yīng)性,發(fā)現(xiàn)Tim-3表達下降時細胞系的吞噬能力提高,對TLRs的反應(yīng)性升高

7、,Tim-3表達升高時變化相反。
　　3、檢測RAW264.7細胞系受到不同濃度LPS或不同時間點LPS刺激后,Tim-3表達呈雙向趨勢,小鼠腹腔巨噬細胞受到不同LPS刺激后,隨著LPS濃度升高Tim-3表達下降;LPS模型時, Tim-3單抗阻斷Tim-3通路后,脾臟細胞因子呈升高趨勢; Tim-3單抗對TLR4-KO-CLP的生存率和脾臟細胞因子沒有明顯影響。
　　結(jié)論:Tim-3低表達或者Tim-3通路的阻斷后膿毒血癥

8、病情加重。因此Tim-3可能在維持膿毒血癥的免疫自穩(wěn)機制中發(fā)揮了一定的作用。另外,巨噬細胞的過度活化能夠?qū)е履摱狙Y的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。當阻斷Tim-3通路或者低表達Tim-3時,巨噬細胞的活化程度卻能夠明顯增強;當巨噬細胞高表達Tim-3時,該細胞上TLRs介導(dǎo)的促炎因子的合成明顯受到抑制,這表明Tim-3是TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的負調(diào)控因子。TLR4與Tim-3通路具有相互抑制的作用,TLR4是Tim-3負調(diào)控反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子。因