短期應(yīng)激對(duì)膿毒血癥的影響及機(jī)制研究.pdf

1、戰(zhàn)時(shí)創(chuàng)傷導(dǎo)致的膿毒血癥是部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗減員的重要因素。戰(zhàn)時(shí)人員往往處于高度應(yīng)激狀態(tài)，在這種情況下，機(jī)體的物質(zhì)代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況和免疫功能會(huì)發(fā)生一系列改變，從而影響機(jī)體的抵抗力，研究應(yīng)激狀態(tài)下的膿毒血癥致死率情況和具體機(jī)制是本課題需要解決的問題。
　　應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體會(huì)激活兩套系統(tǒng)，即下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SNS)。我們知道糖皮質(zhì)激素能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，這一原理已被廣泛應(yīng)用于臨床；但是交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎上腺

2、素能受體對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用，及其在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色，是我們關(guān)注的問題。
　　目的：
　　戰(zhàn)時(shí)創(chuàng)傷導(dǎo)致人體處于應(yīng)激狀態(tài)，在這種情況下，機(jī)體的代謝、免疫功能發(fā)生變化，從而影響到機(jī)體的抵抗力和營(yíng)養(yǎng)狀況。在應(yīng)激條件下，我們從機(jī)體應(yīng)對(duì)膿毒血癥著手，研究其免疫功能的變化情況和具體的機(jī)制，為在營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面進(jìn)行干預(yù)和支持提供新的思路和靶點(diǎn)。從而為解決戰(zhàn)時(shí)創(chuàng)傷所需的營(yíng)養(yǎng)支持提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物

3、分組及喂養(yǎng)
　　Balb／c雄性小鼠，7周齡，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要隨機(jī)分為若干組，每組8只小鼠。
　　2.應(yīng)激動(dòng)物模型的建立
　　采用較常用的束縛應(yīng)激的方法制作短期應(yīng)激動(dòng)物模型，小鼠在連續(xù)三天中被束縛3次，每次3小時(shí)，在一個(gè)直徑2.5cm的可以束縛小鼠動(dòng)作但不會(huì)擠壓小鼠的塑料圓桶中。
　　3.小鼠膿毒癥模型的建立
　　7周齡雄性Balb/c小鼠，采用盲腸結(jié)扎穿孔(C

4、ecal Ligation and Puncture，CLP)方法制作膿毒癥模型，觀察生存率和死亡率。
　　4.小鼠生存時(shí)間的觀察
　　觀察小鼠生存時(shí)間，應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Log-rank生存曲線分析，p<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.小鼠脾臟切除術(shù)
　　打開腹腔將脾臟近端的脾動(dòng)脈和胃動(dòng)脈用縫線系緊并打結(jié)，小心切除脾臟。
　　6.血漿采集
　　小鼠被斷頭處死，收集末梢血樣用于細(xì)胞因子測(cè)量。

5、
　　7.脾臟勻漿準(zhǔn)備
　　小鼠被斷頭處死，脾萃取完后置于冰水水浴器中在磨珠勻質(zhì)器中混勻,然后將勻漿離心(3000g,4℃,10min),取上層清液保存于-80℃環(huán)境下。
　　8.巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，離心（4℃，250×g，10min），去上清，培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL后接種孵育（37℃、5％C02）。2h后去除未貼壁細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)

6、實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.短期應(yīng)激對(duì)小鼠膿毒癥的保護(hù)作用
　　1.1短期應(yīng)激對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用與交感神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系
　　分別檢測(cè)control組（未應(yīng)激組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+6H組（束縛應(yīng)激前7天給予小鼠100mg/kg的6-OHDA損毀交感神經(jīng)，然后再給予束縛應(yīng)激刺激）、6H組（僅給予100mg/kg的6-OHDA）盲腸結(jié)扎穿孔膿毒血癥小鼠的生存率。結(jié)果提示，采用束縛應(yīng)激的小鼠

7、的生存率高于對(duì)照組，短期束縛應(yīng)激降低膿毒血癥小鼠的死亡率，采用6-OHDA損毀交感神經(jīng)后，該保護(hù)效應(yīng)消失，提示該效應(yīng)與交感神經(jīng)釋放神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系密切。
　　1.2短期應(yīng)激對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用與β腎上腺素能受體相關(guān)
　　分別檢測(cè)control組（未應(yīng)激組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+Pro組（每次束縛前60min腹腔內(nèi)注射10mg/kgβ腎上腺素能受體拮抗劑-普萘洛兒）、pro組（僅給予10mg/kg的普萘洛

8、爾）盲腸結(jié)扎穿孔膿毒血癥小鼠的生存率。結(jié)果提示，采用束縛應(yīng)激的小鼠的生存率高于對(duì)照組，短期束縛應(yīng)激降低膿毒血癥小鼠的死亡率，采用β腎上腺素能受體拮抗劑-普萘洛兒后，該保護(hù)效應(yīng)消失，提示保護(hù)效應(yīng)通過β腎上腺素能受體發(fā)揮作用。
　　1.3短期應(yīng)激降低膿毒癥小鼠血液中的炎性因子
　　檢測(cè)了control（sham）組（未應(yīng)激未盲腸結(jié)扎組）、control（sep）組（未應(yīng)激組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+Pro組

9、（每次束縛前60min腹腔內(nèi)注射10mg/kg普萘洛兒）、pro組（僅給予10 mg/kg的普萘洛爾）、stress+6H組（束縛應(yīng)激前7天給予小鼠100mg/kg的6-OHDA，然后再給予束縛應(yīng)激刺激）、6H組（僅給予100mg/kg的6-OHDA）小鼠血漿中TNF-α和HMGB1的濃度。結(jié)果提示，束縛應(yīng)激能夠降低血液中TNF-α和HMGB1的濃度，而且這一效應(yīng)能夠被6-OHDA和普萘洛爾所阻斷
　　1.4短期應(yīng)激后小鼠體內(nèi)去甲

10、腎上腺素濃度提高
　　檢測(cè)了control組（空白對(duì)照組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+6-OHDA組（束縛應(yīng)激前7天給予小鼠100mg/kg的6-OHDA，然后再給予束縛應(yīng)激刺激）、6-OHDA組（僅給予100mg/kg的6-OHDA）膿毒血癥小鼠血漿中去甲腎上腺素（NE）的濃度。又檢測(cè)了control組（空白對(duì)照組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+6-OHDA組（束縛應(yīng)激前7天給予小鼠100mg/

11、kg的6-OHDA，然后再給予束縛應(yīng)激刺激）、6-OHDA組（僅給予100mg/kg的6-OHDA）、stress+Pro組（每次束縛前60min腹腔內(nèi)注射10mg/kg普萘洛兒）、pro組（僅給予10mg/kg的普萘洛爾）膿毒癥小鼠血漿中白介素-10（IL-10）的濃度。結(jié)果提示，束縛應(yīng)激使血液中去甲腎上腺素濃度提升，用6-OHDA能夠破壞交感神經(jīng)末梢，阻斷了去甲腎上腺素的釋放。
　　2.去甲腎上腺素對(duì)巨噬細(xì)胞PPAR以及下游蛋

12、白的調(diào)節(jié)
　　2.1.短期應(yīng)激促進(jìn)PPARγ和ArgⅠ在脾臟巨噬細(xì)胞上的表達(dá)
　　我們用巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物F4/80標(biāo)記脾臟巨噬細(xì)胞。用免疫熒光法測(cè)定PPARγ和Arg1在control組（未應(yīng)激組）、stress組（束縛應(yīng)激組）、stress+6H組（束縛應(yīng)激前7天給予小鼠100mg/kg的6-OHDA損毀交感神經(jīng)，然后再給予束縛應(yīng)激刺激）、6H組（僅給予100mg/kg的6-OHDA）、stress+Pro組（每次束縛

13、前60min腹腔內(nèi)注射10mg/kg普萘洛兒）、pro組（僅給予10mg/kg的普萘洛爾）小鼠脾臟巨噬細(xì)胞上的表達(dá)。結(jié)果提示束縛應(yīng)激促進(jìn)PPARγ和ArgⅠ在脾臟巨噬細(xì)胞上的表達(dá)，用6-OHDA破壞交感神經(jīng)末端或者使用β腎上腺素能受體拮抗劑普萘洛爾能夠拮抗束縛應(yīng)激的作用。
　　2.2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中去甲腎上腺素能夠促進(jìn)PPARγ和ArgⅠ的表達(dá)
　　采用不同劑量的去甲腎上腺素（10-6-10-10M濃度）處理原代腹腔巨噬細(xì)胞，用

14、免疫印跡法檢測(cè)PPARγ,ArgⅠ,UCP2,PGC-1α以及HMGB1的表達(dá)。結(jié)果提示，去甲腎上腺素能夠上調(diào)PPARγ，ArgⅠ,UCP2,PGC-1α的表達(dá)，且其濃度與表達(dá)呈正相關(guān)，NE能夠下調(diào)HMGB1的表達(dá)，且其濃度與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中去甲腎上腺素通過β腎上腺素能受體發(fā)揮效應(yīng)
　　采用β腎上腺素能受體拮抗劑普萘洛爾（10-7M）以及α腎上腺素能受體拮抗酚妥拉明作用于NE（10-8M）處理過的巨噬細(xì)

15、胞，采用免疫印跡法觀察PPARγ,ArgⅠ,UCP2,PGC-1α以及HMGB1的表達(dá)。結(jié)果提示，β腎上腺素能受體拮抗劑普萘洛爾能夠拮抗NE的效應(yīng)，但α腎上腺素受體拮抗劑酚妥拉明對(duì)此并無影響。
　　2.4.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中PPARγ的激動(dòng)劑能夠模擬NE的效應(yīng)
　　PPARγ的拮抗劑GW9662能夠拮抗NE對(duì)于HMGB1和UCP2的效應(yīng)，其激動(dòng)劑RSG能夠模擬NE的效應(yīng)，上調(diào)UCP2，下調(diào)HMGB1，并且該效應(yīng)能夠被UCP2阻斷劑G

16、enipin所阻斷。
　　3.PPARγ以及下游蛋白的調(diào)節(jié)對(duì)小鼠膿毒血癥生存率的影響
　　3.1.PPARγ的拮抗劑能夠阻斷束縛應(yīng)激的保護(hù)效應(yīng)
　　PPARγ的拮抗藥GW9662，使肝臟中Arg1、PPARγ、 UCP2、PGC-1α的表達(dá)降低，使HMGB1的表達(dá)增高，增加HMGB1在血漿的釋放，阻斷了束縛應(yīng)激對(duì)膿毒血癥小鼠的保護(hù)作用。
　　3.2.PPARγ的激動(dòng)劑RSG具有保護(hù)膿毒癥小鼠的效應(yīng)
　　PP

17、ARγ的激動(dòng)劑RSG能夠上調(diào)UCP2的表達(dá)，下調(diào)HMGB1在脾臟的表達(dá)，RSG能夠顯著提升膿毒癥小鼠的生存率，并且生存率與RSG存在劑量依賴關(guān)系，RSG能夠減少血漿中HMGB1的含量。
　　3.3.UCP2拮抗劑Genipin(京尼平)能夠阻斷束縛應(yīng)激保護(hù)效應(yīng)
　　使用UCP2拮抗劑Genipin(京尼平)能夠阻斷束縛應(yīng)激對(duì)于膿毒癥小鼠的保護(hù)作用。
　　3.4.UCP2位于PPARγ信號(hào)通路的下游
　　京尼平能夠