Galectin-1在肝癌中表達的臨床意義及其調(diào)節(jié)肝癌細胞對TRAIL敏感性的研究.pdf

1、研究背景：
　　肝細胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)作為現(xiàn)在全球發(fā)病率以及死亡率極其高的肝臟惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率在全球惡性腫瘤中排第五位，因為它非常高的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，致使肝癌病人的總體預(yù)后非常不樂觀?，F(xiàn)在我國有近1億慢性乙肝病毒攜帶者，而HBV慢性持續(xù)感染是引發(fā)HCC的獨立危險因素，因此，存在著一個龐大的HCC高危人群，繼而導(dǎo)致我們國家的肝癌的病死率居高不下，位于惡性腫瘤排名的第二位。由于H

2、CC起病隱匿、轉(zhuǎn)移早，多半患者在臨床確診時已經(jīng)錯過最佳的切除治療機會，同時肝癌對化療和放療方案的不敏感，加之化放療治療方案副作用較大。雖然目前部分肝癌病人能夠進行實施根治性切除手術(shù)治療，但是70％左右的肝癌切除術(shù)后患者會在5年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)，導(dǎo)致針對原發(fā)性肝癌的治療上來說人們依然需要面對更加龐大的挑戰(zhàn)，因此，更精準的對肝癌病人的預(yù)后進行預(yù)測，采取措施防止肝癌病人肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)、能夠在分子水平提前對肝癌患者的轉(zhuǎn)印進行診斷、同時挑選新型的

3、、有效的、副作用小的治療方法對肝癌病人干預(yù)并使病人得到及時準確的治療對臨床和人類來說有不可小覷的意義，尋找新型的且有用的肝癌的輔助治療手段對提高肝癌的總體生存率顯得尤為重要。
　　人類對分子生物學(xué)以及遺傳學(xué)的技術(shù)認識逐漸地進步，使得我們對惡性腫瘤發(fā)生機制的研究也逐漸地深入。研究提示腫瘤細胞周圍的免疫微環(huán)境，與腫瘤的進展和預(yù)后密切相關(guān)，癌癥細胞就像一粒種子，如果離開合適的土壤就不能發(fā)芽，所以腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅僅取決于腫瘤細胞本身的

4、一些特性，同時也受腫瘤細胞適合生長發(fā)育的土壤的影響，也便是現(xiàn)在人們研究比較多的腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment)。
　　半乳糖凝集素(galectin)（β-半乳糖苷結(jié)合蛋白）是動物凝集素的一種，它分布在多種哺乳動物體內(nèi)的多種器官組織中，實驗表明，它與非常多的生理過程相關(guān)，譬如，細胞的粘附、增殖、分化、凋亡及炎癥，另有肌肉分化、神經(jīng)干細胞的成長及造血譜系等；近年來的研究證實 galectin的表達與腫瘤的增

5、殖、轉(zhuǎn)移、浸潤和復(fù)發(fā)關(guān)系密切，由此，galectin蛋白很有可能成為癌癥治療領(lǐng)域的新治療靶點。Galectin-1是在哺乳動物發(fā)現(xiàn)的第1個半乳糖凝集素，Galectin-1約14 kD（1 D=1 u），位于染色體22 q12上，由LSGALS1基因編碼。
　　研究發(fā)現(xiàn)，galectin-1與T淋巴細胞關(guān)系密切。免疫組織包括中樞的和外周的，而在這些組織的細胞中發(fā)現(xiàn)galectin-1的廣泛存在，galectin-1能夠通過誘導(dǎo)中樞

6、免疫組織胸腺和外周免疫組織中的T細胞的凋亡增加，繼而發(fā)揮穩(wěn)定T淋巴細胞微環(huán)境的作用和功能。研究報道，galectin-1不僅在癌癥的轉(zhuǎn)化和逃避免疫反應(yīng)等生物學(xué)行為中起作用，而且在腫瘤生殖周期、凋亡、細胞遷移和轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。另外，實驗表明，galectin-1在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌和非小細胞肺癌等相當多的惡性腫瘤組織中高表達，并且和腫瘤的增殖和侵襲表型能力相關(guān)。
　　現(xiàn)有研究表明galectin-1參與

7、腫瘤的疾病進展主要從以下幾個方面進行：
　　(1)galectin-1能促進惡性腫瘤細胞的生長。在多種癌癥體內(nèi)模型中，包括卵巢癌、宮頸癌、肺癌、頭頸部腫瘤等，采取相應(yīng)方法，比如，galectin-1的特異性抗體、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染等，使galectin-1的表達下調(diào)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖能力下降。
　　(2)在膠質(zhì)母細胞瘤細胞的體外實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)galectin-1能夠增強膠質(zhì)母細胞瘤細胞的侵襲和遷移能力；進一步的機制研究正事

8、galectin-1蛋白能夠調(diào)控趨化蛋白的合成及分泌從而加強腫瘤細胞的侵襲與遷移能力。
　　(3)galectin-1蛋白能夠依靠加速血管內(nèi)皮細胞的活化及增殖或強化促血管生成路徑增進腫瘤血管生成。galectin-1能夠通過與VEGF彼此作用同時聯(lián)合NRP1繼而增強血管內(nèi)皮細胞的增殖及遷移能力。同時galectin-1能夠減弱腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激反應(yīng)對腫瘤細胞的損傷作用，發(fā)揮保護血管內(nèi)皮細胞的作用。
　　(4)galect

9、in-1與腫瘤的免疫逃逸。侵襲性高的腫瘤細胞高表達galectin-1，同時侵襲性高的腫瘤發(fā)生部位免疫環(huán)境受抑制，提醒我們腫瘤細胞高表達的galectin-1是通過毀壞T細胞效應(yīng)的目的來產(chǎn)生免疫抑制作用。這一機制已得到了大量的實驗驗證，譬如，封鎖黑色素組織中g(shù)alectin-1的生物活性后，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積縮小，同時體內(nèi)腫瘤特異性的T淋巴細胞反應(yīng)被明顯活化。綜上所述，galectin-1蛋白能夠在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要

10、的調(diào)控作用，這也提醒我們將galectin-1蛋白作為惡性腫瘤早期診斷以及預(yù)后判斷的重要標志的可能性，同時開辟為生物治療的新靶點，假使通過此針對性治療能阻斷癌癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，繼而抑制癌癥的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成，或者能通過其改善腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，那將是癌癥治療的創(chuàng)新性的未來。所以，探索galectin-1對腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能作用和機制具有重要的臨床轉(zhuǎn)化意義。而目前，關(guān)于galectin-1蛋白在肝細胞肝癌中功能和原理的實驗研

11、究報道較少。
　　1995年Wiley等［1］從人類心肌cDNA文庫中克隆得到了TNF（tumor necrosis factor）超家族中的一員，TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）即Apo2L（apoptosis-2 ligand）。作為TNF超家族的一員，galectin-1有自己特殊的功能和作用，它能夠?qū)δ[瘤細胞凋亡的具有選擇性誘導(dǎo)，并且更重要的是這個過程中并不損害正常細

12、胞，galectin-1蛋白這個特征使得其與其它T NF超家族成員TNF和FasL之高毒性有很大區(qū)別，另外，TRAIL這一特征使得其在腫瘤治療領(lǐng)域有著重要的臨床應(yīng)用優(yōu)勢，近年來galectin-1蛋白也逐漸成了的腫瘤治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點及基礎(chǔ)研究的熱點。
　　正因為TRAIL表現(xiàn)出的選擇性抗腫瘤優(yōu)勢，故臨床研究中在TRAIL的基礎(chǔ)上的各種類型和作用機制的抗腫瘤方案處于不斷的探索階段。大批臨床試驗證實：某些腫瘤細胞對TRAIL治療表現(xiàn)

13、出抵抗性的原因是由于TRAIL相關(guān)死亡受體的低表達或凋亡抑制蛋白的過高表達。I-Ⅱ期臨床研究結(jié)果證實，如果可以在TRAIL治療基礎(chǔ)之上聯(lián)合應(yīng)用激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑可以很大程度上提高TRAIL耐藥的腫瘤細胞對TRAIL的反應(yīng)。此外由于可溶性TRAIL半衰期短，如果我們在臨床上長期使用也會產(chǎn)生耐藥問題，使得基于TRAIL的腫瘤靶向治療在臨床應(yīng)用中很大程度上受限。
　　某些腫瘤細胞對TRAIL反應(yīng)差，而部分研究表明，如果與某些藥物

14、配合應(yīng)用能很好地提高TRAIL的抗腫瘤能力。同時，隨著科技發(fā)展，尤其是分子成像技術(shù)，辟如生物發(fā)光成像技術(shù)的發(fā)展，使得從化學(xué)文庫中篩選增強TRAIL凋亡誘導(dǎo)活性的分子從不可能變成可能。所有可以改變凋亡相關(guān)分子表達或活性情況的原因，均可以改變TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，有關(guān)TRAIL的腫瘤治療策略會通過人類對TRAIL和它關(guān)聯(lián)的死亡受體的表達情況、TRAIL相關(guān)聯(lián)的凋亡引導(dǎo)過程及此過程的調(diào)節(jié)的深入研究變得更加完善。TRAIL制劑有可能作為人類治療

15、腫瘤的選擇之一。TRAIL的選擇性引起癌細胞凋亡給人們治療HCC的帶來了新想法。TRAIL誘導(dǎo)的有針對性的細胞廣泛凋亡為目前HCC的處理開辟了新方向。一些學(xué)者針對TRAILR的表達情況和TR AIL引起的凋亡情況在HCC中的體現(xiàn)進行了研究，竟然得到TRAILR1/R2/R4存在于6種HCC細胞株中，唯獨TRAILR3單獨存在于2種HCC細胞株中，并且多數(shù)HCC細胞株對單獨的TR AIL存在抗性,同時聯(lián)合使用化療方案能夠增強TRAIL的殺

16、癌作用。
　　基于以上研究背景，本研究擬檢測肝癌細胞和組織中g(shù)alectin-1的表達程度，并探討galectin-1表達程度和HCC病人臨床特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)，探索galectin-1基因成為HCC的分子診斷、預(yù)后判斷指標可能性。同時研究了下調(diào)galectin-1對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響，以及調(diào)節(jié)肝癌細胞對TRAIL敏感性的影響，論證了galectin-1蛋白作為肝癌分子靶向治療的潛在靶點的可能性，為進一步體內(nèi)的實驗研究和臨床應(yīng)

17、用提供理論依據(jù)。
　　第一部分 Galectin-1在肝癌細胞系及肝癌組織中的表達及其與患者臨床預(yù)后的相關(guān)分析
　　目的：
　　研究galectin-1在肝癌組織中的表達及其和臨床特征及預(yù)后的關(guān)系
　　方法：
　　1.利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫中的肝癌基因芯片數(shù)據(jù)分析galectin-1 mRNA在肝癌組織中和癌旁組織的表達強度。
　　2．選用免疫組織化學(xué)方法及肝癌組織芯片技術(shù)檢測 galectin-1蛋

18、白在肝癌組織中的表達程度。
　　3.從mRNA和蛋白水平綜合分析galectin-1表達程度與病人臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果：
　　1．galectin-1 mRNA和蛋白表達水平在肝癌中明顯高于正常肝組織。
　　2．galectin-1蛋白在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者中呈高表達水平。
　　3．galectin-1的高表達提示肝癌患者更短的總生存期，提示galectin-1在肝癌發(fā)生生長過程中可能發(fā)揮重

19、要作用。
　　第二部分體外galectin-1基因敲減后對肝癌細胞生物學(xué)的影響目的：
　　利用RNA干擾技術(shù)沉默galectin-1基因，研究其對肝癌細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲的生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1．將靶向galectin-1的siRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系SK-HEP-1和HUH-7；
　　2．利用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測galectin-1mRNA和蛋白表達水平變化

20、；
　　3．MTT法檢測體外沉默galectin-1基因后對肝癌細胞增殖能力的影響；
　　4．流式細胞儀技術(shù)檢測體外siRNA沉默galectin-1基因后對肝癌細胞凋亡的影響；
　　5．Transwell法檢測體外siRNA沉默galectin-1基因后對肝癌細胞侵襲能力的影響；
　　6．Wound healing法檢測體外siRNA沉默galectin-1基因后下調(diào)對肝癌細胞遷移能力的影響；
　　7．克

21、隆形成實驗檢測體外siRNA沉默galectin-1基因后對肝癌細胞成瘤能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．轉(zhuǎn)染siRNA之后，galectin-1的mRNA和蛋白表達水平降低，敲減實驗成功。
　　2．Galectin-1基因敲減后肝癌細胞系的增殖能力變化不明顯，遷移和侵襲能力以及成瘤能力明顯下降。
　　3. Galectin-1基因敲減后肝癌細胞系的凋亡率明顯升高。
　　第三部分 Galectin-1通過B

22、cl-2和survivin調(diào)節(jié)肝癌細胞對TRAIL敏感性的研究
　　目的：
　　通過構(gòu)建bcl-2和survivin的過表達質(zhì)粒載體，研究galectin-1調(diào)節(jié)肝癌細胞對TRAIL敏感性的初步機制。
　　方法：
　　1．構(gòu)建過表達bcl-2和survivin的質(zhì)粒并鑒定；
　　2．將過表達bcl-2和survivin的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細胞系，用G418進行篩選后，鑒定bcl-2和survivin在肝癌細胞中

23、的mRNA和蛋白表達水平；
　　3．下調(diào)galectin-1對TRAIL受體DR-4，DR-5的影響；
　　4．MTT法檢測galectin-1基因下調(diào)后對TRAIL的敏感性；
　　5．流式細胞儀技術(shù)檢測 galectin-1基因下調(diào)后，TRAIL治療引起的細胞凋亡率；
　　6．流式細胞儀技術(shù)檢測galectin-1基因下調(diào)及過表達bcl-2和survivin后對肝癌細胞的凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　

24、　1．經(jīng)RT-PCR和Western-blot鑒定，過表達bcl-2和survivin的質(zhì)粒構(gòu)建成功；
　　2．下調(diào)galectin-1對TRAIL受體DR-4，DR-5未見明顯影響；
　　3．過表達Bcl-2和survivin能夠逆轉(zhuǎn)下調(diào)galectin-1引起的細胞凋亡；
　　4．下調(diào)galectin-1能夠影響肝癌細胞對TRAIL的敏感性；
　　5．galectin-1通過Bcl-2和Survivin調(diào)節(jié)肝

25、癌細胞對TRAIL的敏感性。
　　全文結(jié)論：
　　1．galectin-1在肝癌中表達明顯升高，并和患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率等臨床惡性表型密切相關(guān)，同時galectin-1低表達患者的生存時間明顯高于galectin-1的高表達患者。
　　2．下調(diào)galectin-1后，肝癌細胞的增殖能力無明顯改變，凋亡率明顯升高，遷移和侵襲能力以及成瘤能力明顯下降。
　　3．下調(diào)galectin-1能夠增加肝癌細胞對TRAIL的敏感性