AFP陽性肝癌細胞靶向表達調(diào)控載體及治療載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時多為晚期，多伴有慢性乙肝、肝硬化，對化療放療不敏感，使得肝癌患者預后不良。基因治療技術(shù)的引入可望緩解肝癌癥狀并延長患者生命。但是，如何使治療基因產(chǎn)物專一地殺傷肝癌細胞，而不損害正常的肝臟細胞及其他正常細胞，提高治療效果，避免毒副作用，是肝癌基因治療的瓶頸。甲胎蛋白是一個在哺乳動物發(fā)育過程中受到嚴格調(diào)節(jié)控制的蛋白質(zhì)，在胚胎時期和肝細胞癌變時AFP基因表達特異性增高，表明肝細胞中有調(diào)控這個基因表達

2、的系統(tǒng)。研究表明AFP基因起始密碼子上游有7kb的調(diào)控序列[1]。在這個調(diào)控區(qū)域有一個組織特異性啟動子，三個獨立的增強子，和一個沉默子。AFP陽性肝癌細胞中的非組織特異性轉(zhuǎn)錄因子和組織特異性轉(zhuǎn)錄因子共同作用于AFP的表達調(diào)控元件[2]，使AFP的表達具有嚴格的時間空間特異性。我們將大鼠來源距離AFP起始密碼子最遠的增強子Ⅲ(-6.1kb～-5.8kb)及其下游的沉默子和啟動子(-900bp～-1bp)進行優(yōu)化組合，構(gòu)建了1.2kb的基因

3、表達調(diào)控序列[3,4,5]，并將其克隆入去除CMV啟動子的pEGFP-N1載體，取代pEGFP-N1質(zhì)粒載體的啟動子，構(gòu)建了pAFP-EGFP質(zhì)粒，將pAFP-EGFP轉(zhuǎn)染AFP陽性人的肝癌細胞HepG2及AFP陰性的人的宮頸癌HeLa細胞和人的SMMC7721肝癌細胞以證明它在AFP陽性肝癌細胞中表達的相對專一性。同時為了驗證這些序列在基因治療中應用的可能性，我們在1.2kb調(diào)控序列下游，連接了抑癌基因P53，構(gòu)建了pAFP-P53一

4、EGFP,將pAFP-P53-EGFP轉(zhuǎn)染AFP陽性人的肝癌細胞HepG2及AFP陰性的人的宮頸癌HeLa細胞和人的SMMC7721肝癌細胞以證明它在AFP陽性肝癌細胞中其具有相對專一的細胞周期阻滯和凋亡作用。 方法： 1、構(gòu)建去CMV的pEGFP-N1質(zhì)粒1.1 連接步驟如下：采用Ase Ⅰ和NheⅠ在37℃將pEGFP-N1質(zhì)粒的啟動子CMV切除。 1.2 酶切后，膠回收4100bp的片段，采用平末端連接試劑

5、盒，將4100bp的兩個末端補平后進行連接。 1.3 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，加入800μl 2×YT培養(yǎng)基孵育60分鐘，卡那平皿鋪板，次日挑克隆，鑒定。 2、pAFP-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建2.1 提取SD大鼠肝臟細胞的DNA，以其為模板擴增甲胎蛋白(AFP)的啟動子900bp和300bp增強子片段，同時通過引物設(shè)計在900bp片段兩端引入SmaⅠ、EcoR Ⅰ酶切位點。300bp增強子片段兩端引入Xhol、Sm

6、a Ⅰ酶切位點。 2.2 將900bp和300bpPCR產(chǎn)物分別膠回收后用Sma Ⅰ進行酶切，純化，將純化后片段在16℃進行連接。 2.3 連接產(chǎn)物1200bp做為模板進行PCR反應，將產(chǎn)物純化后用EcoR Ⅰ和Xhol雙酶切，與去CMv的pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Xhol雙酶切后產(chǎn)物進行連接。 2.4 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，加入800μl 2×YT培養(yǎng)基孵育60分鐘，卡那平皿鋪板，次日挑克

7、隆，鑒定。 3.將構(gòu)建好的pAFP-EGFP分別轉(zhuǎn)染HepG2、SMMC7721、HeLa細胞，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達強度。 4、pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 4.1 以pCMV-P53為模板，通過PCR反應克隆P53基因片段，并且在P53兩端引入EcoR I和BamH I酶切位點。 4.2 同時對P53的PCR產(chǎn)物和pAFP-EGFP進行雙酶切，將酶切后載體和P53片段進行連接，得到

8、pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒。 5、將構(gòu)建好的pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2、SMMC7721、HeLa細胞，以未轉(zhuǎn)染的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞做對照，用Western blot方法檢測P53蛋白表達量的差異。 6、將轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞，用PBS沈滌后，70％的無水乙醇固定，流式細胞儀分析各組細胞周期和凋亡率。

9、 結(jié)果： 1、去CMV的pEGFP-N1質(zhì)粒及pAFP-EGFP質(zhì)粒，經(jīng)酶切及PCR鑒定插入序列正確，構(gòu)建成功。 2、pAFP-EGFP分別轉(zhuǎn)染HepG2、SMMC7721、HeLa細胞，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達強度具有顯著性差異，如圖(Fig.8)所示。 3、pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定構(gòu)建成功。 4、Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP的HepG2、SMM

10、C7721、HeLa細胞，以及未轉(zhuǎn)染的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞P53蛋白表達差異，其灰度對數(shù)值分別為7.20±0.05、6.77±0.16、6.81±0.12、6.67±0.15、6.65±0.25、6.69±0.13。轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP的HepG2細胞P53蛋白的表達量要明顯高于轉(zhuǎn)染的SMMC7721、HeLa細胞及未轉(zhuǎn)染的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞，說明在AFP啟動子的驅(qū)動下，P53融合

11、表達蛋白具有細胞相對專一性。 5、流式細胞分析法檢測轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞周期時相和凋亡率的差異，HepG2組％gate=2.65±0.08、％G1=66.7±0.25、％G2=11.8±0.23、％S=20.1±0.22；HeLa組％gate=0.42±0.025、％G1=50.5±0.18、％G2=20.5±0.19、％S=29.8±0.18；SMMC7721組％gate=

12、0-39±0.018、％G1=5 1.0±0.20、％G2=10.6±0.13、％S=37.8±0，21。由此可見轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的HepG2細胞凋亡率及G1期細胞明顯高于SMMC7721、HeLa細胞(p<0.05)。而HepG2的S期細胞明顯低于SMMC7721、HeLa細胞(p<0.05)。 結(jié)論： 1、pAFP-EGFP表達具有細胞相對專一性，在HepG2細胞中表達強度要明顯高于SMMC77

13、21、HeLa細胞。 2、將轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的HepG2、SMMC7721、HeLa，與未轉(zhuǎn)染的HepG2、SMMC7721、HeLa經(jīng)Western blot檢測分析P53蛋白表達量，轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的均有P53表達，未轉(zhuǎn)染的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞P53表達無顯著差異(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染pAFP-P53-EGFP重組質(zhì)粒的HepG2、SMMC7721、HeLa細胞中，HepG2的P53