加熱誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素納米載體靶向治療肝癌的研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建熱誘導(dǎo)型HSP70啟動(dòng)子調(diào)控內(nèi)皮抑素(Endosmtin，Endo)基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP，獲得目的基因的靶向表達(dá)以及有效的體內(nèi)調(diào)控手段；制備包裹質(zhì)粒DNA的葡聚糖接枝聚乳酸(DEX-PLA)納米微球，獲得靶向性良好和轉(zhuǎn)染有效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體；探討加熱誘導(dǎo)調(diào)控下納米載體介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因治療對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的體外殺傷作用和體內(nèi)抑瘤作用。 方法： 采用PC

2、R技術(shù)，以肝癌細(xì)胞HepG2基因組總DNA為模板，擴(kuò)增熱誘導(dǎo)型HSP70啟動(dòng)子片段；自pSP-Endo/EGFP質(zhì)粒中切取Endo-EGFP融合基因，依次將以上基因序列克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得HSP70啟動(dòng)子調(diào)控內(nèi)皮抑素基因的重組質(zhì)粒pcDNA31(+)/HSP70-Endo/EGFP。 采用化學(xué)偶聯(lián)法合成葡聚糖接枝聚乳酸(DEX-PLA)聚合物。用水/油/水(W/O/W)雙乳化有機(jī)溶劑蒸發(fā)法制備載DNA納

3、米微球，透射電子顯微鏡觀察納米微球的形態(tài)，動(dòng)態(tài)光散射儀檢測納米微球的粒徑分布，用DNase Ⅰ消化實(shí)驗(yàn)檢測納米載體對(duì)DNA的保護(hù)作用。 用載DNA納米微球轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，以Lipofectamine<'TM> 2000作為對(duì)照；轉(zhuǎn)染48h后不同溫度下加熱誘導(dǎo)HSP70啟動(dòng)子調(diào)控Endostatin基因的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測載DNA納米微球在肝癌細(xì)胞HepG2中的轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR檢測不同溫度誘導(dǎo)對(duì)目的基因表達(dá)的影響；

4、MTT法檢測Endostatin基因轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2和人臍內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞增殖的影響。構(gòu)建肝癌裸鼠移植瘤模型，通過瘤內(nèi)注射給藥，觀察腫瘤體積的變化，繪制腫瘤生長曲線；處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，HE染色觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤組織的病理變化。 結(jié)果： 成功擴(kuò)增了熱誘導(dǎo)型HSP70啟動(dòng)子片段，測序結(jié)果與GeneBank中AL671762所提供序列完全一致；構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP，經(jīng)

5、雙酶切鑒定無誤。 紅外光譜表征證實(shí)聚乳酸支鏈的存在，提示DEX-PLA的形成；包裹重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的DEX-g-PLA納米微球，呈球形，粒徑約90-110nm：該載DNA納米微球可有效保護(hù)DNA免遭DNase Ⅰ酶破壞。 載DNA/DEX-PLA納米微球可有效的介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率略低于脂質(zhì)體，而生物相容性則明顯優(yōu)于脂質(zhì)體；低溫加熱可有效誘導(dǎo)目的基因的高表達(dá)

6、，43℃/30min時(shí)最明顯，較未加熱組高3-3倍；RT-PCR證實(shí)mRNA水平的表達(dá)在加熱誘導(dǎo)組與未加熱組存在顯著差異；MTT證實(shí)Endostatin基因可有效抑制ECV304的生長，熱誘導(dǎo)后更明顯，而對(duì)HepG2細(xì)胞增殖無明顯影響。 體內(nèi)試驗(yàn)表明，載Endostatin基因納米微球可抑制腫瘤的生長，并進(jìn)一步縮小腫瘤體積，HE染色顯示治療組腫瘤組織內(nèi)有明顯的壞死灶。 結(jié)論： 擴(kuò)增的ItSP70啟動(dòng)子具有良好的熱

7、誘導(dǎo)性，低溫加熱誘導(dǎo)可有效誘導(dǎo)其下游基因的表達(dá)，可作為靶向基因治療的分子開關(guān)； DEX-PLA納米微球?qū)NA有較好的保護(hù)能力和轉(zhuǎn)基因能力； DEX-PLA納米微球介導(dǎo)pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)人臍內(nèi)皮細(xì)胞ECV304較好的殺傷作用，低溫加熱誘導(dǎo)有明顯增效作用； DEX-PLA納米微球介導(dǎo)pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP瘤內(nèi)轉(zhuǎn)染對(duì)肝細(xì)胞癌有明顯的抑瘤作用，熱