超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因治療肝癌及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:攜內(nèi)皮抑素脂質(zhì)基因超聲微泡的制備
　　第一節(jié):重組人內(nèi)皮抑素質(zhì)粒載體的構(gòu)建、純化及鑒定
　　目的:構(gòu)建重組人內(nèi)皮抑素真核表達(dá)載體并制備脂質(zhì)超聲微泡攜帶目的基因。方法:根據(jù)目的基因片段設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增并純化，然后將純化的目的基因與pEZ-M46載體分別酶切并進(jìn)行連接，構(gòu)建內(nèi)皮抑素基因重組真核表達(dá)載體pEZ-M46-ES，并轉(zhuǎn)化至大腸肝菌，進(jìn)行菌落PCR、酶切分析和DNA測(cè)序鑒定重組克隆。

2、結(jié)果:經(jīng)雙酶切電泳和DNA測(cè)序分析證實(shí)，重組克隆載體內(nèi)的目的基因片段序列與GENEBANK上報(bào)道的Endostatin基因序列基本一致，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全相同。結(jié)論:成功構(gòu)建了人重組內(nèi)皮抑素基因質(zhì)粒載體。
　　第二節(jié):微泡基因載體的制備及基本特性檢測(cè)
　　目的:研制性能穩(wěn)定、高效的微泡類基因載體以攜帶目的基因。方法;采用成膜水化法、膜擠壓法和機(jī)械振蕩法分別制備脂質(zhì)超聲微泡和納米脂質(zhì)體，通過生物素-親和素法將微泡-納米

3、脂質(zhì)體連接起來，以構(gòu)建載基因量高的微泡類載體；在配方中加入帶正電荷的成膜材料DC-膽固醇(DC-cholesterol)，通過機(jī)械振蕩法制備陽離子脂質(zhì)超聲微泡，光鏡下觀察微泡形態(tài)，并對(duì)其體外基本特性(濃度、粒徑、表面電荷)、增強(qiáng)超聲顯像效果、載基因特性等進(jìn)行考察。結(jié)果光鏡下顯示，納米脂質(zhì)體被成功連接到了脂質(zhì)微泡表面，然而其連接效率差，濃度過低；成功制備了陽離子脂質(zhì)超聲微泡，微泡表面形態(tài)規(guī)整，大小均一，分散度好，其濃度、粒徑及表面電荷分別

4、為3.13±0.26×109/ml，1.6+0.29μm，21.07±5.30 mV。在造影模式下，能顯著增強(qiáng)兔肝臟超聲顯像，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。普通微泡帶負(fù)電荷或不帶電荷，攜帶基因能力低，而陽離子微泡攜帶較多正電荷，載基因量顯著增加。兩者的基因結(jié)合率分別為4.33±1.47％和31.45±5.16％。結(jié)論納米脂質(zhì)體-超聲微泡復(fù)合物不符合超聲造影劑要求，無法作為基因載體攜帶目的基因聯(lián)合超聲進(jìn)行下一步的靶向治療研究；陽離子脂質(zhì)超聲微泡具備超聲造影

5、劑的基本特性，并可成為一種高效的基因載體。
　　第二部分:超聲破壞陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
　　第一節(jié):超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成的影響
　　目的:探索超聲破壞微泡介導(dǎo)基因治療的最佳聲學(xué)條件，然后以陽離子微泡作為基因載體，聯(lián)合超聲介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，研究其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成的抑制作用。方法:將pEZ-M46-ES質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用

6、質(zhì)粒抽提試劑盒擴(kuò)增純化質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，首先采用不同強(qiáng)度超聲進(jìn)行分組處理，分別為：0.1、0.2、0.3、0.5 W/cm2，然后將超聲強(qiáng)度固定為0.1 W/cm2，加入不同濃度微泡后聯(lián)合處理，微泡濃度分別為：1、3、5、7×108/ml，根據(jù)細(xì)胞存活情況篩選出最佳超聲強(qiáng)度和微泡濃度組合，然后按以下分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理：①空白對(duì)照組(C)，②質(zhì)粒+脂質(zhì)體組(P+L)

7、，③質(zhì)粒+超聲輻照組(P+US)，④質(zhì)粒+陽離子微泡組(P+US)，⑤質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(P+MB++US)。①組以空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，②組以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染作為陽性對(duì)照，③組觀察單獨(dú)超聲基因轉(zhuǎn)染的影響，④組觀察單獨(dú)陽離子微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的效果，⑤組測(cè)試超聲破壞陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染的效果。對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行處理后24h，(1)在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，并收集細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；以MTT法觀察各

8、組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，計(jì)算抑制率；(2)Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Endostatin的表達(dá)情況。(3)將HUVEC細(xì)胞接種至預(yù)先鋪好Matrigel的Ttranswell中，建立體外人造微血管模型，同上進(jìn)行分組處理，24 h后進(jìn)行固定、染色，觀察血管網(wǎng)的形成數(shù)量。結(jié)果超聲強(qiáng)度為0.1和0.2W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率未受明顯影響，達(dá)到0.3W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率出現(xiàn)一定程度降低，達(dá)到0.5W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率急劇下降。超聲

9、強(qiáng)度固定為0.1 W/cm2，微泡濃度為7×108/ml時(shí)，細(xì)胞存活率輕度降低。分組轉(zhuǎn)染pEZ-M46－ES質(zhì)粒后，倒置熒光顯微鏡下可觀察P+MB+US組和P+L組均有大量細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，P+US組和P+MB組僅少數(shù)細(xì)胞表達(dá)熒光，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率各實(shí)驗(yàn)組分別為：31.24±8.3％，12.57±0.67％，3.14±0.72％，30.64±8.5％。MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)P+MB+US組和P+L組HUVEC細(xì)胞移抑制率顯著高于其他各組

10、，但兩組間差異無顯著性，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為：33.47±0.67％，15.49±2.56％，3.23±1.97％，35.52±8.67％；轉(zhuǎn)染pEZ-M46-ES質(zhì)粒后，western blot法可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因后細(xì)胞內(nèi)Endostatin的表達(dá)。各組HUVEC細(xì)胞形成網(wǎng)狀血管結(jié)構(gòu)數(shù)量分別為28.47±3.52，9.17±1.62，22.19±4.33，25.26±5.31，4.42±1.52。結(jié)論:最佳

11、超聲強(qiáng)度與微泡濃度組合為0.1 W/cm2+7×108/ml，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，與質(zhì)粒+超聲或單獨(dú)陽離子微泡相比，超聲破壞微泡能顯著增強(qiáng)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的效率，提高其表達(dá)水平，但與脂質(zhì)體相比，差異無顯著性。轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因能夠明顯抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能抑制HUVEC細(xì)胞網(wǎng)狀血管結(jié)構(gòu)的形成。
　　第二節(jié):超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移特性的影響
　　目的:以陽離子微泡作為基因載體，通

12、過超聲破壞微泡作用介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，研究?jī)?nèi)皮抑素對(duì)HepG2細(xì)胞遷移、侵襲、克隆形成及誘導(dǎo)血管形成能力的影響。方法:常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，按以下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染pEZ－M46-ES質(zhì)粒：①空白對(duì)照組(C)，②質(zhì)粒+超聲輻照組(P+US)，③質(zhì)粒+陽離子微泡組(P+MB)，④質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(P+MB++US)。處理后通過化痕法、Transwell系統(tǒng)和Matrigel人工基底膜檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲情況

13、；通過軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)(Soft agar)觀察各組HepG2細(xì)胞增殖形成克隆的能力；將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因后與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)于Transwell系統(tǒng)，觀察HUVEC細(xì)胞血管網(wǎng)形成情況，并以ELISA法檢測(cè)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果: HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEZ-M46－ES質(zhì)粒，P+MB++US組穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞克隆形成的數(shù)量明顯少于其他組，與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，誘導(dǎo)血管形成的數(shù)量也

14、低于其他組。P+US組和P+MB組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，與對(duì)照組相比，P+US組遷移、侵襲細(xì)胞和形成克隆數(shù)量有一定減少，誘導(dǎo)HUVEC形成血管數(shù)量少于對(duì)照組，但P+MB組與對(duì)照組相比未見明顯改變。ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)P+MB++US處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF表達(dá)水平最低。結(jié)論:超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2細(xì)胞遷移、侵襲、克隆形成及誘導(dǎo)血管形成能力具有明顯的抑制作用。
　　第三部分:超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因?qū)Ω伟?/p>

15、H22移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　目的:研究超聲破壞微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌H22移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法:(1)將pEZ－M46－ES質(zhì)粒與陽離子微泡進(jìn)行孵育，得到載內(nèi)皮抑素基因微泡。常規(guī)懸浮培養(yǎng)小鼠H22細(xì)胞，離心收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以5.3×107/ml接種至昆明小鼠背部皮下，每只小鼠注射0.2ml腫瘤細(xì)胞懸液。(2)經(jīng)小鼠尾靜脈注射陽離子載基因微泡0.2ml，在超聲造影模式下觀察微泡增強(qiáng)腫瘤顯

16、像情況。(3)將20只荷瘤小鼠隨機(jī)分為以下4組分別進(jìn)行處理：①生理鹽水對(duì)照組，②質(zhì)粒+超聲組，③空白微泡+超聲組，④單獨(dú)陽離子載基因微泡組，⑤陽離子載基因微泡+超聲組。微泡經(jīng)尾靜脈輸注，超聲輻照在注射后立即進(jìn)行，采用本研究所研制的超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照整個(gè)腫瘤部位，輻照條件：1MHz、2W/cm2，輻照10s，間隔5s，共5min。每周處理兩次，連續(xù)三周。首次處理前以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑，隨后每周測(cè)量?jī)纱巍Ｈ缓笥?jì)算腫瘤體積，描繪生長(zhǎng)

17、曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤稱重，計(jì)算抑瘤率，并以石蠟包埋、切片，通過免疫組化染色，計(jì)算腫瘤微血管密度(MVD)結(jié)果:在超聲造影模式下，經(jīng)小鼠尾靜脈注射載基因微泡后5 s，小鼠移植瘤部位出現(xiàn)微泡充盈，10 s達(dá)到高峰，增強(qiáng)持續(xù)時(shí)間超過10 min。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，超聲破壞載內(nèi)皮抑素基因微泡治療能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，該治療組腫瘤體積明顯小于其他組；腫瘤生長(zhǎng)明顯較對(duì)照組和其他組緩慢，而改組抑瘤率最高，達(dá)70.1％。免疫組化結(jié)果顯示