納米超聲微泡介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性不完全脊髓損傷.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury SCI）是一種可逆性差、致殘率高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍是一大醫(yī)學(xué)難題。脊髓損傷的基因治療目前尚處于探索階段，雖然基因治療脊髓損傷在體外實驗和動物實驗都取得了重大進(jìn)展，但仍有許多問題亟待解決，如外源性基因的安全性、轉(zhuǎn)染后表達(dá)及其持續(xù)性、免疫排斥反應(yīng)、倫理性問題等。雖然還沒有一種基因治療方法可應(yīng)用于臨床治療脊髓損傷，但利用目的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)特性來保護(hù)

2、神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元再生，以及抑制局部膠質(zhì)瘢痕增生等，最終達(dá)到脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)，是目前治療脊髓損傷的研究方向。
　　近年來，超聲靶向微泡破裂（UTMD）技術(shù)成為基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域研究的熱點，其技術(shù)原理主要是體外目的基因或藥物與超聲微泡結(jié)合，然后將載基因或藥物超聲微泡導(dǎo)入體內(nèi)，再進(jìn)行體外超聲輻照，利用超聲微泡在超聲輻照下的產(chǎn)生的空化效應(yīng)，在細(xì)胞膜上形成可逆孔隙，從而使目的基因或藥物更容易進(jìn)入細(xì)胞達(dá)到靶向治療目的。
　　本課題以神經(jīng)生長

3、因子（NGF）基因作為目的基因，在優(yōu)化超聲微泡制備工藝的基礎(chǔ)上，制備出一種高效的載NGF基因的PLGA納米超聲微泡，然后通過超聲靶向微泡破裂技術(shù)（UTMD）介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性脊髓損傷，最后采用HE染色、尼氏染色、免疫熒光技術(shù)、Westernblot、qRT-PCR、神經(jīng)元凋亡檢測以及神經(jīng)功能恢復(fù)評估等方法觀察NGF基因在損傷脊髓組織中的表達(dá)情況，神經(jīng)元再生情況及大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，初步評估NGF/PLGA納米微泡治療急性不完全

4、脊髓損傷的療效，以期為治療脊髓損傷提供一種新的思路和治療方法。
　　第一部分、載NGF基因PLGA納米超聲微泡的制備和性能檢測
　　目的：制備一種包載神經(jīng)生長因子基因（NGF）的聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）納米超聲微泡，并研究NGF/PLGA納米超聲微泡的理化性質(zhì)。
　　方法：采用雙乳化法制備NGF/PLGA納米超聲微泡，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測其粒徑、電位及分散系數(shù)，測定其基因包封率及體外超聲輻照下基因釋放情況，并在不同

5、濃度梯度及時間梯度下觀察其超聲顯像效果。
　　結(jié)果：NGF/PLGA納米超聲微泡在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察下呈球形，形態(tài)均勻，大小較一致，分散度良好。NGF/PLGA納米超聲微泡的平均粒徑為215.3±55.29nm，Zeta電位為-11.3±5.65mV，分散系數(shù)為0.027。紫外分光光度法檢測其基因包封率為34.33±2.02%；體外超聲輻照后12小時GF/PLGA納米超聲微泡基因累積釋放率達(dá)到52.7%，48小時后基因累積

6、釋放率達(dá)到62.6%。體外超聲顯像結(jié)果顯示NGF/PLGA納米超聲微泡性能穩(wěn)定，其超聲回聲強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng)，在48小時內(nèi)其平均超聲回聲強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：本實驗所準(zhǔn)備的載NGF基因的納米超聲微泡形態(tài)均勻、大小一致，分散度良好，包載基因效率高，且具有較好的顯像性能，理化性質(zhì)穩(wěn)定，是一種理想的基因載體。
　　第二部分、超聲靶向破裂技術(shù)介導(dǎo)NGF基因治療大鼠急性不完全脊髓損傷
　　目的：探討超聲靶向破裂技術(shù)

7、介導(dǎo)NGF/PLGA納米超聲微泡治療鼠急性不完全脊髓損傷可行性及效果。
　　方法：構(gòu)建大鼠急性不完全脊髓損傷模型（Allen法），148只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組：A組：生理鹽水（NS）組；B組：NGF+空白微泡（NGF+NBs）組；C組：NGF+超聲（NGF+US）組；D組：NGF/PLGA NBs+超聲（NGF/PLGA NBs+US）組，每組37只。經(jīng)尾靜脈注射藥物后再經(jīng)相關(guān)處理后，在不同時間點采用組織學(xué)蘇木精和伊紅染色

8、（HE）觀察脊髓損傷后的病理變化；尼氏染色法（Nissl）觀察神經(jīng)元存活及再生情況；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色法檢測神經(jīng)元凋亡情況；采用RT-PCR和Western blotting法檢測NGF基因和蛋白的表達(dá)情況；通過倒置熒光顯微鏡觀察偶聯(lián)綠色熒光蛋白的表達(dá)情況；最終采用Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB)法評估大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：與其他治療組

9、相比，NGF/PLGA NBs+US治療組能明顯增加NGF基因的表達(dá)，減輕脊髓組織損傷，減少神經(jīng)元的丟失，能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。
　　結(jié)論：超聲靶向破裂技術(shù)介導(dǎo)NGF/PLGA納米超聲微泡能有效地將NGF基因轉(zhuǎn)染入損傷脊髓組織，并能促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。以NGF/PLGA NBs為基礎(chǔ)的超聲輻照聯(lián)合基因治療在治療脊髓損傷及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景，為脊髓損傷的治療提供了一種新型、安