超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因治療視網(wǎng)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分.普通脂質(zhì)及陽離子微泡制備及性能檢測
　　目的:構(gòu)建普通脂質(zhì)微泡（NMB）、陽離子微泡（CMB），并檢測其基本物理特征；比較NMB和CMB攜載內(nèi)皮抑素質(zhì)粒（pEZ-M46-ES）的能力。
　　方法:采用機(jī)械震蕩法構(gòu)建兩種不同的脂質(zhì)微泡，通過在成膜材料中加入DC-膽固醇（DC-cholesterol）使微泡表面帶正電荷從而構(gòu)建陽離子微泡（CMB），光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài)，并檢測其濃度、粒徑、表面電位及載基因能力等基

2、本特性。
　　結(jié)果:NMB、CMB均成功構(gòu)建，光鏡下大小均一，分散度較好；其表面電荷、粒徑及濃度分別為+25.62±4.38mV，1.64±0.28μm，4.16±0.18×109/ml。固定微泡的濃度為5×108/ml，兩者的載基因量分別為2.01±0.74μg和19.02±0.76μg。
　　結(jié)論:NMB及CMB制備成功。
　　第二部分.超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　目的:研

3、究NMB、CMB攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染HRECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，以及對細(xì)胞周期、體外血管成型及細(xì)胞遷移的影響。并與脂質(zhì)體載體進(jìn)行對比。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分組：①空白對照組（C）②質(zhì)粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)③質(zhì)粒+脂質(zhì)體組（L）④質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以空白對照組，②組以超聲輻照普通微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染作為陽性對照，③組以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染作為陽性對照，④組以超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)

4、內(nèi)皮抑素基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。超聲（1MHz,1W/cm2, and50％duty cycle(DC),30seconds）作用下轉(zhuǎn)染HRECs，轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期，qPCR及Western-blot分別檢測endostatin, VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA及蛋白表達(dá)情況，通過體外血管成型及細(xì)胞遷移評價(jià)內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在不同載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后的治療效果。
　　結(jié)果:各組轉(zhuǎn)染pEZ-M46-ES質(zhì)粒后2

5、4h基因轉(zhuǎn)染率分別為:1.20±0.21%，28.25±0.57%，30.74±7.50%和41.84±8.90%；轉(zhuǎn)染后24h及48h流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期顯示CMB組處于G1期的細(xì)胞較其他各組明顯增多；MTT檢測結(jié)果顯示CMB組對HRECs的生長曲線較其他各組有明顯抑制作用；qPCR及Western blot檢測顯示CMB組endostatin mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯增加，而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋

6、白表達(dá)較其他各組明顯減少；各組HRECs形成網(wǎng)狀新生血管的數(shù)量分別為26.47±3.52，15.17±1.52，13.19±3.43，8.42±1.02個(gè)；各組HREC細(xì)胞遷移數(shù)量分別為：30±1.57，22.4±2.07，21.6±2.17，15.4±2.7個(gè)。
　　結(jié)論:與普通脂質(zhì)微泡和脂質(zhì)體作為基因載體相比，CMB組基因轉(zhuǎn)染效率明顯提高；普通脂質(zhì)微泡與脂質(zhì)體也可增加基因轉(zhuǎn)染效率，但兩者基因轉(zhuǎn)染效率無明顯差別。超聲輻照微泡介導(dǎo)

7、內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染HRECs，可明顯抑制體外血管成型及細(xì)胞生長、增殖及遷移。
　　第三部分.內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈笠暰W(wǎng)膜新生血管的抑制作用
　　目的:分別以脂質(zhì)體、普通微泡和陽離子微泡作為基因載體，后兩者聯(lián)合超聲輻照，介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染小鼠視網(wǎng)膜，比較其抑制新生血管的效果并探討其可能機(jī)制。
　　方法:分別將普通微泡，脂質(zhì)體及陽離子微泡與pEZ-M46-ES質(zhì)粒進(jìn)行孵育，得到載基因的脂質(zhì)體或微泡。采用高濃度氧誘導(dǎo)C57BL/

8、6J小鼠建立OIR(Oxygen-inducedretinopathy,氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變)動物模型。將60只視網(wǎng)膜新生血管模型小鼠,隨機(jī)分為以下3組：①質(zhì)粒+普通離子微泡+超聲輻照組(NMB)②質(zhì)粒+脂質(zhì)體組（L）③質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組(CMB)。①組以超聲輻照普通微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染，②組以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，③組以超聲輻照陽離子微泡介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染。小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型建造后用微量注射器按以上分組右眼玻璃體

9、腔注射基因及載體復(fù)合物2μl，①、③組在注射后立即使用超聲輻照眼球。左眼作為對照組（C）。于注射后5天行視網(wǎng)膜組織切片HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目；注射后5、14、28d激光共聚焦顯微鏡下觀察各組pEZ-M46-ES的熒光表達(dá)強(qiáng)度，qPCR法檢測各組視網(wǎng)膜組織中endostatin、VEGF、bcl-2和bcl-xl mRNA的表達(dá)情況，Western blot法檢測各組視網(wǎng)膜組織中endostatin、VEGF、b

10、cl-2和bcl-xl的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:視網(wǎng)膜組織切片HE染色結(jié)果示CMB組小鼠突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)較其他各組顯著減少，各組細(xì)胞核個(gè)數(shù)分別為：41.7±6.1，26.1±1.4，23.1±3.5，16.4±1.2個(gè)。激光共聚焦顯微鏡下觀察并計(jì)算視網(wǎng)膜色素上皮層熒光強(qiáng)度所有數(shù)值的平均值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后5及14d，NMB組、L組及CMB組的pEZ-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后28d各組 pE

11、Z-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度較第14d減弱，CMB組與NMB組及L組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；NMB組與L組在轉(zhuǎn)染后5d及14d兩組之間的熒光表達(dá)強(qiáng)度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在轉(zhuǎn)染后28d，NMB組的pEZ-M46-ES熒光表達(dá)強(qiáng)度較L組強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。視網(wǎng)膜組織qPCR及Western blot檢測顯示CMB組endostatin的 mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組明顯增加，而VEGF、bcl-2和bcl-xl的mRNA及蛋白表達(dá)較其他各組