超聲破壞微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植促血管新生的作用.pdf

1、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和基因工程技術(shù)的改進(jìn)，治療缺血性疾病的方法也在不斷的進(jìn)步，其中通過(guò)干細(xì)胞移植促進(jìn)血管新生以改善血供是現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。干細(xì)胞移植方法主要包括導(dǎo)管內(nèi)注射、肌內(nèi)注射和靜脈注射，前兩種方法均有創(chuàng)傷性，安全性也受到質(zhì)疑。經(jīng)靜脈途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone Marrow Mesenchymal stem cells，MSCs）則具有損傷小，操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，易為患者接受等優(yōu)點(diǎn)，卻因移植效率低下，靶向性差而受到限

2、制，因而發(fā)展一種能有效介導(dǎo)干細(xì)胞靜脈移植的方法至關(guān)重要。 超聲微泡造影劑的應(yīng)用使得超聲醫(yī)學(xué)不僅在診斷方面有所突破，而且在治療方面的潛力也備受關(guān)注。最近研究表明，經(jīng)靜脈輸入白蛋白微泡造影劑的同時(shí)用超聲照射骨骼肌局部，然后用免疫組織化學(xué)方法觀察骨骼肌中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮Ⅷ因子表達(dá)情況，可見(jiàn)充血性營(yíng)養(yǎng)血流量及新生細(xì)動(dòng)脈，揭開(kāi)了超聲破壞微泡促進(jìn)血管新生并改善組織局部血供方面的潛力。新近研究發(fā)現(xiàn)超聲破壞微泡聯(lián)合干細(xì)胞移植可進(jìn)一步改

3、善缺血組織局部血流量，但是該技術(shù)的作用機(jī)制、安全性、靶向性等均不清楚。本文擬將超聲破壞微泡技術(shù)與干細(xì)胞移植聯(lián)合起來(lái)，探討該項(xiàng)技術(shù)促進(jìn)血管新生的可行性、安全性及靶向性，并初步揭示該項(xiàng)技術(shù)的作用機(jī)制。為介導(dǎo)干細(xì)胞移植及治療缺血性疾病提供一種新的思路。 第一部分、超聲破壞微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植的可行性研究。 目的： 初步探討超聲破壞微泡對(duì)經(jīng)靜脈途徑移植MSCs的作用、安全性及靶向性。 方法： 21只清潔級(jí)W

4、ister大鼠，離斷右側(cè)股動(dòng)脈，建下肢缺血模型，7d后隨機(jī)分為3組：干細(xì)胞靜脈移植組（MSCs-iv）、超聲+干細(xì)胞組（US+ MSCs-iv）、超聲+微泡+干細(xì)胞組（US+MB+ MSCs-iv）。各組分別取1只大鼠的骨骼肌行HE染色觀察顯微結(jié)構(gòu)。移植后第7d，取各組剩余大鼠右側(cè)下肢缺血骨骼肌行免疫組化檢測(cè)，觀察MSCs移植數(shù)量；另外US+MB+MSCs-iv組同時(shí)取重要臟器行免疫組化檢測(cè)，評(píng)估其靶向性；多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差

5、分析，兩兩比較采用LSD法。 結(jié)果： US+MB+MSCs-iv組缺血骨骼肌組織HZ染色可見(jiàn)紅細(xì)胞外溢，但未見(jiàn)肌纖維溶解； US+MB+MSCs-iv組缺血骨骼肌組織移植的MSCs數(shù)量為（3.22±1.03），顯著高于US+ MSCs-iv組（0.67±0.60）及MSCs-iv組（0.27±0.44）（P=0.000）。US+MSCs-iv組與MSCs-iv組兩者相比無(wú)顯著性差異（P=0.373）。另外在US+MB+

6、MSCs-iv組大鼠脾臟發(fā)現(xiàn)大量MSCs歸巢，而在腎臟、肝臟及心臟未發(fā)現(xiàn)MSCs異位歸巢。 結(jié)論： 超聲靶向破壞微泡可以提高干細(xì)胞移植效率，并具有較好的靶向性和安全性，有可能成為介導(dǎo)干細(xì)胞移植的新方法。 第二部分、超聲破壞微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植促進(jìn)血管新生的研究。 目的： 探討超聲破壞微泡聯(lián)合MSCs靜脈移植治療大鼠缺血下肢骨骼肌組織的作用。 方法： 36只清潔級(jí)Wister大鼠，離斷

7、右側(cè)股動(dòng)脈，建下肢缺血模型，7d后隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（Control）、超聲+微泡組（US+MB）、干細(xì)胞靜脈移植組（MSCs-iv）、超聲+微泡+干細(xì)胞組（US+MB+MSCs-iv）。取右側(cè)缺血下肢骨骼肌組織，分別用免疫組化技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)VEGF表達(dá)量及CD34表達(dá)情況；另外利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGFmRNA表達(dá)量；兩組數(shù)據(jù)間的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。 結(jié)果：

8、 US+MB組缺血骨骼肌組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表達(dá)量較多，Control組VEGF蛋白表達(dá)量很少；US+MB組VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.27±0.30），Control組VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.52±0.16），兩者相比差異有顯著性（P=0.001）；US+MB+MSCs-iv組血管數(shù)量為（7.39±1.50），比US+MB組（

9、5.17±0.50）及Control組（1.83±0.62）顯著增加（P=0.000）； US+MB組血管數(shù)量較之MSCs-iv組（2.11±0.78）顯著增加（P=0.000）。 結(jié)論： 超聲空化微泡聯(lián)合干細(xì)胞移植有可能成為一種治療缺血性疾病的新方法。 第三部分、探討超聲破壞微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植增強(qiáng)血管新生作用的機(jī)制。 目的： 探討超聲破壞微泡增強(qiáng)MSCs移植效率及強(qiáng)化血管新生作用的可能機(jī)制。

10、 方法： 18只清潔級(jí)Wister大鼠，離斷右側(cè)股動(dòng)脈，建下肢缺血模型，7d后隨機(jī)分為3組，超聲+微泡組（US+MB）經(jīng)頸靜脈輸入白蛋白微泡造影劑1ml，同時(shí)用1.5MHz，1.9 W/c㎡的超聲在其缺血骨骼肌局部間歇作用180 s；超聲組（US）僅在缺血骨骼肌局部用同等參數(shù)的超聲作用；第3組作為對(duì)照組（Control）。各組大鼠于處理后24 h處死，檢測(cè)炎癥因子E-選擇素（E-selectin）mRNA相對(duì)表達(dá)量及單核細(xì)胞

11、趨化因子-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1）mRNA相對(duì)表達(dá)量.多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。 結(jié)果： US+MB組E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)量（0.88±0.24）顯著高于US組（0.52±0.05）（P=0.001）及Control組（0.48±0.03）（P=0.000），US組E-selectin mRNA相對(duì)表達(dá)量與Co