超聲微泡介導基因轉(zhuǎn)染防治移植靜脈再狹窄的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：探討超聲微泡造影劑結(jié)合超聲輻照能否提高增強型綠色熒光蛋白報告基因質(zhì)粒（Pegfp）在大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）的轉(zhuǎn)染效率，及其對細胞活性的影響。
　　 方法：實驗分為A、B、C、D四組，分別為空白對照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+超聲輻照組、質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組。使用診斷超聲儀照射體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞，輻照條件為超聲探頭頻率為10MHz，機械指數(shù)為1.9，輻照時間為10min，添加或不添

2、加超聲微泡造影劑，Pegfp濃度為5μg/ml, 輻照后臺盼藍染色檢測細胞活性（生存率），48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的轉(zhuǎn)染表達率。
　　 結(jié)果：A、B、C、D四組的細胞生存率分別為（97.43±2.63）％、（97.52±1.64）％、（96.83±2.31）％及（95.21±1.36）％，各組間無顯著性差異（P>0.05）；GFP轉(zhuǎn)染表達率分別為（0.12±0.42）％、（1.31±0.71）％、（4.45

3、±3.13）％及（21.48±2.16）％，D組的GFP轉(zhuǎn)染表達率與其余各組比較差異具有顯著意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：造影劑微泡結(jié)合超聲輻照能顯著提高Pegfp在VSMC的轉(zhuǎn)染效率，而對細胞的活性基本無影響，可作為基因轉(zhuǎn)染的一種有效方法。
　　 第二部分
　　 目的：探討微泡造影劑及超聲輻照介導內(nèi)皮型一氧氣化氮合成酶（Enos）基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）的可行性。
　　 方法

4、：實驗分為A、B、C、D、E五組，分別為空白對照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組、質(zhì)粒+超聲輻照組、質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組。用重組真核表達載體pcDNA3.1-Enos經(jīng)微泡造影劑及超聲輻照介導轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞，輻照條件為超聲探頭頻率為10MHz，機械指數(shù)為1.9，輻照時間為10min，重組真核細胞表達載體pcDNA3.1-Enos 5μg/ml。 輻照48h后，采用RT-PCR、Western blot及免疫組

5、化檢測VSMC內(nèi)eNOSmRNA和蛋白的表達。
　　 結(jié)果：RT-PCR檢測質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組eNOSmRNA的表達最顯著，IOD比值為(91.11±3.41)％，單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組、質(zhì)粒+超聲輻照組也有少量表達，IOD比值分別為(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％，與E組相比P<0.05。蛋白印跡分析Enos蛋白表達，空白對照組有極少量表達，單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)

6、粒+微泡造影劑組也有少量表達，IOD比值分別為(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％；而質(zhì)粒+超聲輻照+造影劑組表達最明顯，IOD比值為(84.22±9.22)％，與各組相比P<0.05。
　　 結(jié)論：超聲輻照結(jié)合造影劑微泡能顯著提高Enos基因在VSMC的轉(zhuǎn)染效率，提高細胞內(nèi)一氧化氮合成酶的表達。
　　 第三部分
　　 目的：探討微泡造影劑結(jié)合超聲輻照介導基因轉(zhuǎn)染移

7、植靜脈橋的可行性。
　　 方法：建立SD大鼠頸外靜脈-頸總動脈移植模型，選擇增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(Pegfp)為報告基因。將大鼠頸外靜脈段浸泡入粘附質(zhì)粒的微泡中，予超聲照射，再將靜脈段間置植入頸總動脈，2d后，取出靜脈段行快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察血管平滑肌內(nèi)熒光表達，同時進行蘇木精-伊紅染色行病理觀察。
　　 結(jié)果：微泡造影劑結(jié)合超聲輻照組的熒光強度顯著高于質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組、質(zhì)粒+微泡造影劑組及單純質(zhì)粒浸泡組

8、(P<0.05)。蘇木精-伊紅染色觀察血管組織并無壞死灶的出現(xiàn)。
　　 結(jié)論：微泡造影劑結(jié)合超聲輻照可以實現(xiàn)基因靶向轉(zhuǎn)染至大鼠移植靜脈橋的血管平滑肌中。
　　 第四部分
　　 目的：探討微泡造影劑及超聲輻照介導內(nèi)皮型一氧氣化氮合成酶基因轉(zhuǎn)染防治移植靜脈血管橋再狹窄的可行性。
　　 方法：重組真核表達載體pcDNA3.1-Enos經(jīng)微泡造影劑及超聲輻照介導體外轉(zhuǎn)染大鼠頸外靜脈，再將靜脈段間置植入頸總動脈，建

9、立SD大鼠頸外靜脈頸總動脈旁路移植模型。于術(shù)后四周，取移植靜脈標本分別進行蘇木精-伊紅染色，免疫組織化學染色及Western blot分析，觀察內(nèi)皮一氧化氮合成酶基因在靜脈橋中的功能表達和靜脈橋新生內(nèi)膜的增生情況。結(jié)果 微泡造影劑及超聲輻照介導內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因轉(zhuǎn)染組的移植血管橋內(nèi)一氧化氮合成酶基因在靜脈橋中的功能表達明顯強于模型對照組、單純質(zhì)粒浸泡組、質(zhì)粒+微泡造影劑組及質(zhì)粒浸泡+超聲輻照組；內(nèi)膜增生明顯減弱，再狹窄程度顯著低于