超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑介導的基因靶向轉染.pdf

1、隨著分子生物學的發(fā)展和基因工程技術的改進，基因治療的研究不斷取得進步，超聲微泡造影劑的應用使得超聲醫(yī)學不僅在診斷方面有所創(chuàng)新，而且其在基因治療方面潛在的應用價值也備受關注，具有廣闊的應用前景。 基因治療時，治療基因必須到達靶細胞，進入細胞核，然后再經(jīng)過轉錄、翻譯為蛋白質，才能起到治療作用，基因導入體內的方法有直接注射和靜脈注射法，如果不用某種方式使這些治療性基因保持穩(wěn)定，經(jīng)靜脈注射后通常會被血清酶快速清除，或很難通過內皮細胞屏障

2、。在靜脈給藥途徑中，要防止基因物質在血液中被降解，人們已經(jīng)嘗試各種不同的被覆物質作為基因的載體來改善基因物質的轉移，新近研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡聲學造影劑可成為基因治療中一種安全、有效的載體，在聲像圖的監(jiān)控下進行超聲輻照，微泡能夠在指定部位“爆破”，釋放出所攜帶的基因。國內外學者對此在活體動物研究領域僅取得一些初步進展，需要對超聲及微泡增強基因轉染的方法學和機制進行深入探討，這些對于超聲及微泡做為一種新型的基因載體在基因治療領域中的發(fā)展與高層

3、次理解至關重要。本文擬通過體內實驗探討增強型綠色熒光蛋白質粒(EGFP)僅在大鼠骨骼肌微血管通透性增加的條件下表達的可行性并評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實現(xiàn)基因轉染的靶向性。為建立一種新型、安全、高效的基因轉染模式奠定初步的實驗基礎。 第一部分：超聲聯(lián)合微泡造影劑對大鼠脊斜肌微血管通透性的影響 目的：研究治療劑量超聲破壞微泡造影劑對大鼠脊斜肌毛細血管通透性的影響。 方法：以伊文思藍(EvansBlue,EB)為指

4、示劑，18只清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機均分為伊文思藍組(E)、伊文思藍+超聲組(E+U)和伊文思藍+超聲+微泡組(E+U+M)共3組進行實驗。給予相同參數(shù)條件的超聲進行照射，經(jīng)頸動脈輸／不輸入微泡造影劑，應用在體熒光顯微鏡觀察EB外溢情況并行視覺評分；使用標準曲線和分光光度法測量各組大鼠脊斜肌中EB的含量。 結果：E+U+M組鏡下可見微血管周圍EB外溢，視覺評分等級為2級，E組評分0級，E+U組評分0-

5、1級。E+U+M組脊斜肌中EB含量為(51.57±3.89)μg/g，顯著高于E組[(28.99±4.67)μg／g]及E+U組[(30.99±4.11)μg／g](P=0.000)。E組及E+U組兩者相比無顯著性差異。 結論：超聲介導微泡造影劑破壞可使大鼠脊斜肌組織毛細血管通透性增加，可能是超聲微泡造影劑增強基因轉染的主要機制之一。 第二部分：超聲微泡造影劑介導EGFP質粒轉染大鼠脊斜肌的實驗研究 目的：探討增

6、強型綠色熒光蛋白質粒(EGFP)在大鼠脊斜肌微血管通透性增加的條件下表達的可行性。 方法：20只清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機均分為裸質粒組(P)、質粒+超聲組(P+U)、質粒+微泡組(P+M)和質粒+超聲+微泡組(P+U+M)共4組進行實驗。選擇增強綠色熒光蛋白質粒與白蛋白微泡相混合，以超聲介導白蛋白微泡破裂的方法對大鼠脊斜肌行基因轉染，轉染7d后，熒光顯微鏡下觀察質粒在大鼠脊斜肌組織中的表達情況。

7、 結果：P、P+M組大鼠脊斜肌組織中均未見增強型綠色熒光蛋白表達；P+U組可見少量微弱綠色熒光，熒光強度較P和P+M組顯著增強(P<0.05)，P+U+M組可見顯著特異性增強型綠色熒光蛋白表達，熒光強度約為P、P+M組的10倍，P+U組的3倍(P<0.05)；P+U+M組轉染率為40.60±8.80％較之P+U組(12.60±3.25％)顯著增高(P=0.001)。 結論：超聲介導微泡造影劑破裂造成的脊斜肌組織毛細血管通透性的

8、增加，是血管內基因成功跨越內膜屏障的主要途徑之一。 第三部分：評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實現(xiàn)基因轉染靶向性的研究 目的：評價超聲聯(lián)合白蛋白微泡造影劑實現(xiàn)基因轉染的靶向性。 方法：選擇增強型綠色熒光蛋白質粒為報告基因，經(jīng)股靜脈輸入黏附質粒的白蛋白微泡的同時在大鼠背部脊斜肌區(qū)域經(jīng)皮輔予一定強度的超聲照射對大鼠脊斜肌行基因轉染，轉染7d后，取脊斜肌、肝、腎、心肌組織快速冷凍切片，熒光顯微鏡下觀察各組織內的熒光表達。