超聲介導(dǎo)微泡造影劑對(duì)細(xì)胞和微血管以及基因在HUVEC內(nèi)轉(zhuǎn)染率的影響的研究.pdf

1、本研究旨在：通過(guò)觀察超聲介導(dǎo)MBCA對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的作用，靜脈注射USMBCA對(duì)大鼠心肌組織毛細(xì)血管及肌纖維的作用，以及使用超聲介導(dǎo)MBCA對(duì)綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EPGFP)對(duì)HUVEC的轉(zhuǎn)染效率的影響，探討USMBCA是否可以作為基因治療的一種安全、有效的載體及其機(jī)理，應(yīng)用超聲介導(dǎo)MBCA對(duì)HUVEC作用各種相關(guān)的適宜參數(shù)。 材料與方法：1.培養(yǎng)細(xì)胞。配制MBCA-聲諾維(SonoVue)。

2、 2.應(yīng)用MTT比色實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度MBCA對(duì)HUVEC活性的影響本實(shí)驗(yàn)分組如下：根據(jù)添加MBCA的濃度不同，分為A組：MBCASonoVue濃度為50mg/ml，每孔加50μl；B組：MBCASonoVue濃度為25mg/ml；每孔加50μl；C組：MBCASonoVue濃度為17mg/ml，每孔加50μl；D組：MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml，每孔加50μl；E組：對(duì)照組，每孔加生理鹽水50μl；F組：空白對(duì)照組，

3、不加細(xì)胞及MBCA，每孔加入200μl培養(yǎng)液。以上六組每組重復(fù)8孔。0.25％胰酶消化HUVEC單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，以每孔含104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積150μl。如上所述，每組加入不同濃度的MBCA。進(jìn)行超聲輻照后，培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí)，然后每孔加入MTT溶液10μl，37℃繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每空加入二甲基亞楓(DMSO)150μl，振蕩10分鐘。選49

4、0nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。MTT測(cè)細(xì)胞活性，加入0.9％Nacl組的細(xì)胞存活率為100％，每組各孔細(xì)胞的存活率為：每組各孔細(xì)胞的吸光值與加入0.9％Nacl組各孔細(xì)胞的吸光值的比值的百分比。 3.不同濃度MBCA對(duì)HUVEC凋亡及活性的影響用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)將濃度調(diào)至1×106/ml，將1ml細(xì)胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中

5、。根據(jù)添加MBCA的濃度不同，分為A組：MBCASonoVue濃度為50mg/ml；B組：MBCASonoVue濃度為25mg/ml；C組：MBCASonoVue濃度約17mg/ml；D組：MBCASonoVue濃度為12.5mg/ml。以上四組每孔加MBCASonoVue300μl。E組：對(duì)照組，每孔加生理鹽水300μl。以上五組每組重復(fù)6孔。超聲輻照后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。按照Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑

6、盒說(shuō)明操作，然后用熒光顯微鏡(FMS)觀察加入不同濃度MBCA，HUVEC凋亡和壞死細(xì)胞的情況，F(xiàn)MS下綠色細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，紅色細(xì)胞為晚期凋亡和死亡細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡及存活率。 4.超聲介導(dǎo)MBCA對(duì)HUVEC細(xì)胞膜的作用實(shí)驗(yàn)分組：A組：正常對(duì)照組；B組：?jiǎn)渭兂曒椪战M；C組：MBCA組，以上各組均為一皿；D組：MBCA+超聲輻照組，兩皿。用含10％FBS的1640培養(yǎng)液配成HUVEC懸液，計(jì)細(xì)胞數(shù)

7、將濃度調(diào)至1×106/ml，將1ml細(xì)胞懸液接種到直徑35mm單孔聚乙烯培養(yǎng)皿中。C組、D組各加濃度為17mg/ml的MBCASonoVue，每孔加300μl。B組、D組用超聲輻照，輻照后立即各組取一皿細(xì)胞送電鏡室進(jìn)行掃描電鏡(SEMS)觀察。D組的另一皿細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行SEMS觀察。 5.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將16只大鼠隨機(jī)分為4組，每組4只，A組：正常對(duì)照組；B組：超聲輻照組，C組：MBCA組；D組：MBCA+超

8、聲輻照組。用10％水合氯醛(1～2ml/kg)對(duì)大鼠行腹腔麻醉，之后胸部脫毛。C組、D組大鼠經(jīng)股靜脈輸入含氟碳?xì)怏wMBCA(0.5ml/每只)，注射時(shí)間約1分鐘，然后使用HP5500超聲診斷儀，S4探頭在B組、D組大鼠胸壁超聲輻照6分鐘，破壞心肌組織內(nèi)的MBCA。超聲輻照時(shí)采用contrast程序，間歇harmonic成像，探頭發(fā)射頻率為1.8MHz接收頻率為3.6MHz，機(jī)械指數(shù)1.6，聚焦深度4cm，采用心電觸發(fā)，每7個(gè)心動(dòng)周期觸發(fā)

9、一次。其余設(shè)置取該程序默認(rèn)值，保持儀器各項(xiàng)設(shè)置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不變。透射電鏡(TEMS)觀察：超聲輻照后。立即剪斷大鼠肋骨，取左心室前壁心肌，送電鏡室做TEMS觀察。 6.基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)分組如下：A組：HUVEC；B組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000；C組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡；D組：HUVEC+EPGFP+Lipofectami

10、ne2000+超聲輻照；E組：HUVEC+EPGFP+Lipofectamine2000+SonoVue微泡+超聲輻照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。用不同條件的超聲輻照。輻照后立即將上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，之后用FMS觀察EPGFP在HUVEC內(nèi)的表達(dá)，并且使用FCM測(cè)出EPGFP在HUVEC內(nèi)的轉(zhuǎn)染率。 結(jié)果：1.應(yīng)用MTT比色實(shí)驗(yàn)，不同濃度MBCA對(duì)HUVEC活性的影響不同。超聲介導(dǎo)初MBCA及其稀釋2倍時(shí)細(xì)胞存活率較低；初MBCA

11、稀釋3倍時(shí)細(xì)胞存活率增高，且較前兩者有明顯差異(P＜0.01)，初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時(shí)比較，對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響(P＞0.05)。 2.應(yīng)用Annexin-v-FITC和PI雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)不同濃度MBCA對(duì)HUVEC活性、凋亡及壞死的影響不同。超聲介導(dǎo)初MBCA時(shí)存活細(xì)胞百分比較小，晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比較多；初MBCA稀釋2倍時(shí)存活細(xì)胞百分比增多，晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比減少，較前者有明顯差異(P＜

12、0.01)；初MBCA稀釋3倍時(shí)存活細(xì)胞百分比進(jìn)一步增大，晚期凋亡和壞死細(xì)胞百分比進(jìn)一步變小，且與初MBCA或其稀釋二倍時(shí)有明顯差異(P＜0.01)；初MBCA稀釋4倍與稀釋3倍時(shí)比較對(duì)細(xì)胞存活、晚期凋亡和壞死百分比無(wú)顯著影響(P＞0.05)。超聲介導(dǎo)初MBCA稀釋3倍時(shí)，早期凋亡細(xì)胞百分比明顯減小，且與初MBCA或其稀釋二倍時(shí)有明顯差異(P＜0.01)，初MBCA稀釋4倍時(shí)與初MBCA稀釋3倍時(shí)比較對(duì)早期凋亡細(xì)胞百分比無(wú)顯著影響(P＞

13、0.05)。 3.超聲介導(dǎo)MBCA可使大約23％HUVEC的細(xì)胞膜呈現(xiàn)直徑約2微米的小孔，該細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后再進(jìn)行SEMS觀察小孔關(guān)閉，細(xì)胞膜恢復(fù)正常。 4.TEMS觀察，超聲介導(dǎo)MBCA組，大鼠心肌組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜破損、溶解，內(nèi)皮細(xì)胞線粒體空泡變性，細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚；血管壁破裂，可見(jiàn)紅細(xì)胞外溢；心肌纖維斷裂、溶解。 5.EPGFP對(duì)HUVEC轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，F(xiàn)MS下實(shí)驗(yàn)組的HUVEC內(nèi)可見(jiàn)特異性

14、EPGFP表達(dá)，超聲+微泡組EPGFP表達(dá)量明顯增多。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的EPGFP對(duì)HUVEC的轉(zhuǎn)染率。 結(jié)論：1.超聲破壞MBCA能明顯提高脂質(zhì)體介導(dǎo)的EPGFP對(duì)HUVEC的轉(zhuǎn)染率。USMBCA可作為基因治療的載體。 2.SonoVue可增強(qiáng)超聲的空化效應(yīng)，使HUVEC膜上出現(xiàn)可逆性小孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)。空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)MBCA增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染率主要機(jī)制之一。