超聲輻照微泡增強(qiáng)脂質(zhì)體介導(dǎo)肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一節(jié)超聲輻照微泡促進(jìn)肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的參數(shù)優(yōu)化 目的：觀察超聲輻照微泡對(duì)正常肝細(xì)胞生長狀態(tài)的影響并優(yōu)化其促進(jìn)肝細(xì)胞株L02基因轉(zhuǎn)染的參數(shù)。 方法：采用MTT比色法檢測單純超聲、單純微泡和超聲輻照微泡對(duì)正常肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)生存率的影響及用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和檢測超聲輻照微泡介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒對(duì)L02細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的效率，并以此優(yōu)化聲照參數(shù)和微泡劑量。 結(jié)果：MTT比色法結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)固定聲強(qiáng)為0.5 W/cm

2、<'2>，輻照時(shí)間為30 s、60 s和90 s時(shí)，各組細(xì)胞存活率分別為92.45％、85.78％和31.65％；采用不同濃度微泡對(duì)L02細(xì)胞作用24 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組細(xì)胞存活率比較無顯著性差異(P>0.05)；超聲+微泡(40μl)組L02細(xì)胞，光密度值下降，細(xì)胞存活率降低，與對(duì)照組比較差異有顯著性。超聲輻照微泡10μ1、 20μl、 30μl各亞組的L02細(xì)胞生長狀態(tài)良好;熒光顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)在超聲輻照微泡組及脂質(zhì)

3、體組均可見明亮的綠色熒光，對(duì)照組組未見熒光；流式細(xì)胞儀分析各組轉(zhuǎn)染效率顯示脂質(zhì)體組、超聲輻照微泡10μl微泡亞組、20μl微泡亞組、30μl微泡亞組、40μl微泡亞組轉(zhuǎn)染效率分別為18130％、10.14％、14.65％、18.54％、10.06％，而對(duì)照組未見基因轉(zhuǎn)染。 結(jié)論：超聲頻率為1MHz、能量為0.5 W/cm<'2>輻照微泡(微泡濃度1.8×10<'7>個(gè)/ml)輻照時(shí)間為60秒可顯著促進(jìn)EGFP基因在L02細(xì)胞的表

4、達(dá)，并對(duì)L02細(xì)胞生長狀態(tài)無明顯影響。 第二節(jié)超聲輻照微泡增強(qiáng)脂質(zhì)體介導(dǎo)肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察超聲輻照微泡聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)pIRES-EGFP/HGF質(zhì)粒對(duì)人正常肝細(xì)胞株L02的基因轉(zhuǎn)染效率。 方法：將培養(yǎng)的肝細(xì)胞分為5組，①單純對(duì)照組，②脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，③超聲輻照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，④超聲輻照微泡轉(zhuǎn)染組，⑤超聲輻照微泡+脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組。采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀法觀察及檢測各組L02細(xì)胞pIRES-EGFP/

5、HGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的情況及效率；用MTT和ELISA法分別檢測各組L02細(xì)胞增殖率及上清液中HGF含量。 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示脂質(zhì)體組、超聲輻照脂質(zhì)體組、超聲輻照微泡組、超聲輻照微泡+脂質(zhì)體組轉(zhuǎn)染效率分別為18.32％、18.46％、18.47％、23.17％，對(duì)照組未見基因轉(zhuǎn)染。ELISA法結(jié)果顯示，超聲輻照微泡+脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清液中HGF含量最高與其余各組比較差異有顯著性(P<0.05)；MTTT比色法結(jié)果顯示對(duì)照組