超聲微泡造影劑介導(dǎo)EGFP質(zhì)粒對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是最常見的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤。目前的治療方式有直接摘除眼球及剜出眼眶內(nèi)容物、化學(xué)減容法、激光光凝、溫?zé)岑煼?、冷凍療法、外照放療等?；蛑委熒刑幱谘芯侩A段。微泡造影劑作為一種新型的基因轉(zhuǎn)移載體，在聲像圖的監(jiān)控下進(jìn)行超聲輻照，微泡能夠在指定部位“爆破”，釋放所攜帶的基因。本文通過體外實(shí)驗(yàn)研究超聲微泡造影劑攜帶EGFP基因?qū)σ暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的效率及探討最適轉(zhuǎn)染條件。 全文分為三個部分，依次對微泡造影劑及超聲對體外

2、培養(yǎng)的RB細(xì)胞生長活性的影響、微泡攜帶EGFP基因轉(zhuǎn)染RB細(xì)胞的最適聲強(qiáng)時間條件、以微泡為基因載體與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率對比作了研究。 第一部分檢測了微泡造影劑和超聲對體外培養(yǎng)的RB細(xì)胞生長活性的影響。將培養(yǎng)的RB細(xì)胞分為9組，其中5組分別予以超聲條件為0．25，0．5，0．75，1．O，1．25W／cm2聲強(qiáng)，作用時間均為60s的連續(xù)波照射。另4組RB細(xì)胞分別予以1％，10％，20％,30％的濃度梯度的微泡造影劑。用O．4％

3、臺盼藍(lán)直接染色10min，顯微鏡觀察，計數(shù)被染色(死)細(xì)胞和拒染(活)細(xì)胞。染色結(jié)果顯示：當(dāng)超聲強(qiáng)度為0．25、0．5及0．75W／cm2，時間60s時，細(xì)胞存活率均>95％；當(dāng)超聲強(qiáng)度為1．O及1．25W／cm2，時間60s時，細(xì)胞存活率<80％。微泡濃度為l％、10％、20％時，細(xì)胞存活率均>90％；微泡濃度為30％時，細(xì)胞存活率<80％。在0．25～0．75W／cm2、60s范圍內(nèi)的超聲，和低于20％的微泡濃度，對RB細(xì)胞的生存無

4、影響。 第二部分在第一部分的基礎(chǔ)上，以幾種不同的超聲條件對RB細(xì)胞進(jìn)行EGFP基因轉(zhuǎn)染。RB細(xì)胞分為4組：微泡濃度固定為10％，超聲聲強(qiáng)分別為0．25，0．5，0．75W／cm2，60s，連續(xù)波發(fā)射進(jìn)行轉(zhuǎn)染(共3組)；并增加一組對照組(微泡濃度固定為10％，超聲聲強(qiáng)1．OW／cm2，60s，連續(xù)波發(fā)射)。培養(yǎng)24～48h后，在熒光顯微鏡488nh2下觀察EGFP蛋白的表達(dá)情況，并以RT-PCR定量檢測mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：0．

5、5W／cm2及0．75W／cm2聲強(qiáng)處理過的RB細(xì)胞可見較多綠色熒光及較亮的電泳條帶，且二者表達(dá)情況相似。而聲強(qiáng)0．25W／cm2及1．OW／em2處理組中RB細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均不如上述兩種聲強(qiáng)條件。 第三部分將微泡攜帶基因的轉(zhuǎn)染效率與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行了對比。RB分為4組，以不同的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行EGFP基因的轉(zhuǎn)染。①裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、②質(zhì)粒+超聲照射轉(zhuǎn)染、③質(zhì)粒+微泡+超聲照射轉(zhuǎn)染、④質(zhì)粒+脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)24～48h后，在熒光顯微鏡4

6、88nlTl下觀察EGFP蛋白的表達(dá)情況，并以RT-PCR定量檢測mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：第③組(質(zhì)粒+微泡+超聲照射組)和第④組(質(zhì)粒+脂質(zhì)體組)可見較多綠色熒光，及較亮的電泳條帶；另兩組轉(zhuǎn)染效率欠佳。 本實(shí)驗(yàn)以超聲微泡造影劑為基因載體對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，探討了其對RB細(xì)胞生長活性的影響、合適的轉(zhuǎn)染條件，并與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行了比較。然而RB的基因治療尚處于起步階段，真正應(yīng)用于臨床需進(jìn)一步的研究。 ，