超聲微泡介導(dǎo)bcl-xl基因抗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討超聲微泡介導(dǎo)報(bào)告基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)中的轉(zhuǎn)染效率、優(yōu)化轉(zhuǎn)染的條件及毒性。評(píng)價(jià)超聲微泡介導(dǎo)bcl-xl基因抗RGCs凋亡作用。 方法：第一步：體外培養(yǎng)RGCs。 第二步：以綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因?yàn)閳?bào)告基因，微泡造影劑(聲諾維)為載體，用超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀輻照介導(dǎo)GFP真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP—M轉(zhuǎn)染RGCs。實(shí)驗(yàn)組為質(zhì)粒組(a組)、微泡+質(zhì)粒組(b組

2、)、超聲+質(zhì)粒組(c組)、超聲+微泡+質(zhì)粒組(d組)。d組根據(jù)轉(zhuǎn)染條件不同進(jìn)一步分成不同亞組。對(duì)照組為空白對(duì)照組(e組)及脂質(zhì)體組(f組)。熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察GFP表達(dá)情況，MTT法測(cè)定RGCs的活性。 第三步：建立N一甲基一D一天冬氨酸(NMDA)誘導(dǎo)的RGCs凋亡模型。將體外培養(yǎng)的RGCs分為正常對(duì)照組(A組)，NMDA誘導(dǎo)組(B組)，bc卜xl基因轉(zhuǎn)染-}-NMDA誘導(dǎo)組(C組)。C組在加入NlvlDA前48h采用

3、第二步實(shí)驗(yàn)得的最佳轉(zhuǎn)染效率參數(shù)，超聲微泡介導(dǎo)bc卜xl基因轉(zhuǎn)染GRCs，轉(zhuǎn)染48h后采用免疫組化分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的bc卜xl蛋白水平。加入NMDA36h后采用A0／EB(吖啶橙／溴化乙錠)雙熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，瓊脂糖電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡的DNA片斷。 結(jié)果：1．采用多聚賴(lài)氨酸聯(lián)合鼠尾膠原作為貼壁基質(zhì)的RGCs生長(zhǎng)良好，部分細(xì)胞伸出突起，且突起相互連接成網(wǎng)狀。 2．超聲微泡介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染RGCs在優(yōu)化轉(zhuǎn)

4、染條件下即頻率300KHz，聲強(qiáng)1．25W／cm2，連續(xù)波，照射時(shí)間60s，微泡濃度45g~ml，質(zhì)粒濃度50p~ml，24孔板培養(yǎng)的RGCs轉(zhuǎn)染率較高，為(26．87±3．12)％，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染率為(14．21±2．59)％，兩種轉(zhuǎn)染法之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值=36．45，P

5、染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的bcl-xl蛋白表達(dá)水平有差異，加入NMDA36h后AO／EB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B組可見(jiàn)大量凋亡小體，C組可見(jiàn)少許凋亡細(xì)胞。瓊脂糖電泳檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)B組呈典型DNA“梯度”條帶，而A組和C組無(wú)明顯DNA“梯度”條帶。 結(jié)論：1．RGCs能在體外成功培養(yǎng)；多聚賴(lài)氨酸聯(lián)合鼠尾膠原是RGCs體外生長(zhǎng)的良好支持物。 2．在一定條件下，超聲破裂微泡能增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染與表達(dá)，有望成為一種安全、有效的基因載體。 3．bcl