Humanin抗低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷作用的研究.pdf

1、目的：
　　 青光眼是一種不可逆的高致盲率眼病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近幾年來,隨著對青光眼診治水平的提高和青光眼視神經(jīng)損害機(jī)制研究的深入,青光眼視神經(jīng)的保護(hù)越來越受到人們的重視,在青光眼的治療中,只有在去除原發(fā)病因,降低眼壓的同時(shí),注重視神經(jīng)的保護(hù)性治療,阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)一步損害,保護(hù)視功能,才能使青光眼的治療達(dá)到最佳效果。
　　 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡是最終導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的重要因素,越來越多的研究表明:過高的

2、眼內(nèi)壓,局部的缺血缺氧,免疫反應(yīng)等危險(xiǎn)因素可以誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激,啟動細(xì)胞內(nèi)多種蛋白參與凋亡信號的級聯(lián)反應(yīng),造成神經(jīng)元的凋亡與丟失,導(dǎo)致患者出現(xiàn)漸進(jìn)性的視功能障礙。挽救和修復(fù)受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡,使受損的細(xì)胞軸突再生并重新恢復(fù)功能是治療青光眼性視神經(jīng)病變的重要途徑。視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,目前,有越來越多的學(xué)者不再僅僅把青光眼當(dāng)做一種單純的眼科疾病,而是認(rèn)為青光眼是一種引起腦神經(jīng)細(xì)胞退行性變性和

3、死亡的神經(jīng)疾病,與阿爾茨海默病及帕金森病等具有相似之處。許多中樞神經(jīng)保護(hù)劑如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BD-NF)等都被證實(shí)同樣對RGCs具有保護(hù)作用。Humanin(HN)是一種由24個(gè)氨基酸殘基(MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRA)組成的多肽,2001年首先由日本學(xué)者Hashimoto等在阿爾茨海默病患者的大腦枕葉內(nèi)發(fā)現(xiàn)。由于阿爾茨海默病患者的枕葉在發(fā)病過程極少

4、受累,他們據(jù)此推測,大腦枕葉的神經(jīng)元一定啟動了某種基因的表達(dá),并由此形成了特殊的保護(hù)機(jī)制,使神經(jīng)元免受阿爾茨海默病病變過程的毒性作用而死亡。最終他們通過從阿爾茨海默病患者枕葉提取的mRNA建立了包含開放讀碼框的cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)了一種由75bp開放讀碼框架(ORF)編碼的24個(gè)氨基酸殘基組成的新型多肽,并將其命名為Humanin。研究發(fā)現(xiàn),在離體培養(yǎng)的細(xì)胞中,HN能有效抑制多種FAD基因(APP、PS-1和PS-2)、Aβ完整肽鏈(Aβ

5、1-43或(Aβ1-42)及其衍生物((Aβ25-35或Aβ31-35)誘發(fā)的神經(jīng)毒作用;而且在大鼠體內(nèi)AD模型中也發(fā)現(xiàn)了Humanin的神經(jīng)保護(hù)作用。因此Humanin被認(rèn)為是AD特異或AD相關(guān)毒性(AD-relatedinsults)的神經(jīng)保護(hù)肽。但后來的大量研究表明,Humanin可以在非AD相關(guān)的因素如興奮性神經(jīng)毒,缺氧等誘導(dǎo)的神經(jīng)及非神經(jīng)細(xì)胞的損傷中都能起到細(xì)胞保護(hù)作用。除此之外,HN在腦組織以外的其他組織及不同的動物種屬如正

6、常大鼠的睪丸、結(jié)腸,MELAS型線粒體腦肌病患者的骨骼肌以及人類頸動脈粥樣硬化斑塊中都可見表達(dá)分布。另有研究報(bào)道稱FIN可拮抗線粒體功能障礙,抑制不同途徑的凋亡,還可以拮抗細(xì)胞內(nèi)的鈣離子超載。HN的這些作用特點(diǎn)強(qiáng)烈提示,HN極有可能具有廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用,是具有廣譜保護(hù)作用的內(nèi)源性神經(jīng)活性多肽,而不只是針對某種特定損傷(如AD相關(guān)毒性)而產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　 FIN可能非常特異地阻止某些與細(xì)胞死亡有關(guān)的細(xì)胞通路,從而對控制細(xì)胞的

7、死亡起到非常重要的作用。為了進(jìn)一步研究FIN是否對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡能起到阻斷作用,我們以化學(xué)低氧誘導(dǎo)劑氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5(RGC-5)死亡,并以HN進(jìn)行干預(yù),從而檢測FIN對于低氧誘導(dǎo)的RGC-5損傷是否具有保護(hù)作用。另外,本試驗(yàn)還就HN對低氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與Bax,Bcl-2,和Caspase-3的表達(dá)、細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行檢測,探討HN能否通過調(diào)節(jié)Bax,Bcl-2,和Caspase

8、-3的表達(dá),抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過建立視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5(RGC-5)的體外化學(xué)低氧誘導(dǎo)損傷模型,探討不同濃度Humanin(HN)對體外低氧誘導(dǎo)培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的影響作用;探討HN預(yù)處理對低氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制是否涉及對凋亡的抑制。
　　 方法：
　　 將處于對數(shù)生長期的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞-5細(xì)胞分為三組:空白對照組、低氧誘導(dǎo)組、HN預(yù)處理

9、組。在細(xì)胞成功培養(yǎng)后,HN預(yù)處理組加入HN預(yù)處理12h,再與低氧誘導(dǎo)組一同加入最終濃度為200μM的CoCl2,繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞用于指標(biāo)檢測。采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率,Hoechst33342染色及AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,應(yīng)用westernblot法測定細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值及活化的Caspase-3表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 MTT比色法顯示20gMHN預(yù)處理組細(xì)胞活性明

10、顯高于低氧誘導(dǎo)組(P＜0.01);Hoechst33342染色及流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示HN預(yù)處理組較低氧誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0.01);westernblot法顯示:20gMHN預(yù)處理組Bcl-2/Bax較低氧誘導(dǎo)組增加,活化Caspase-3蛋白表達(dá)較低氧誘導(dǎo)組減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 低氧處理后可導(dǎo)致RGC-5的損傷,一定濃度的HN可增加低氧誘導(dǎo)損傷的RGC-5細(xì)胞的生存率