急性低壓缺氧視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷及牛磺酸防護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、低壓缺氧(hypobaric hypoxia,HBH)是海拔大于3000m地區(qū)如高山、高原、高空等的重要環(huán)境因素。視網(wǎng)膜是對缺氧高度敏感的神經(jīng)組織,未經(jīng)習(xí)服者進(jìn)入低壓缺氧環(huán)境則會(huì)出現(xiàn)暗適應(yīng)時(shí)間延長、視力下降、色覺減退等視功能障礙,嚴(yán)重者出現(xiàn)眼底病改變甚至失明。以往研究認(rèn)為急性低壓缺氧視網(wǎng)膜功能障礙主要是視網(wǎng)膜內(nèi)動(dòng)靜脈失代償性擴(kuò)張、視乳頭水腫、眼底出血等所致,而對視網(wǎng)膜神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)功能變化的報(bào)道甚少。視網(wǎng)膜主要由光感受器-雙極細(xì)胞-神經(jīng)

2、節(jié)細(xì)胞三級神經(jīng)元組成,研究發(fā)現(xiàn),急性低壓缺氧早期反映視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元功能的振蕩電位(oscillatory potentials,Ops)異常,以及模擬高原缺氧大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層結(jié)構(gòu)疏松、變厚等現(xiàn)象,提示急性低壓缺氧視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能損害。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retina ganglion cells,RGCs)位于視網(wǎng)膜內(nèi)層,是視覺信息傳遞的重要中繼神經(jīng)元,其通過樹突和胞體上的突觸收集來自雙極細(xì)胞的視覺信號,經(jīng)過整合后以動(dòng)作電位沿軸突即視神

3、經(jīng)快速傳遞至視覺中樞,RGCs損傷勢必導(dǎo)致視覺功能障礙,因此,深入認(rèn)識急性低壓缺氧暴露時(shí)RGCs結(jié)構(gòu)與功能變化及其病理機(jī)制,并尋找合適的防護(hù)劑具有重要意義。
　　 針對神經(jīng)元缺氧損傷可能的病理機(jī)制,國內(nèi)外已進(jìn)行大量研究,主要認(rèn)為:①線粒體功能障礙是神經(jīng)元缺氧損傷的中心環(huán)節(jié)。缺氧條件下,一方面,線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián),細(xì)胞能量ATP供應(yīng)不足,可干擾神經(jīng)元細(xì)胞膜上Na+、K+離子通道以及受體特性,影響神經(jīng)元電生理功能實(shí)現(xiàn);另一方面,

4、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeability transition pore,MPTP)異常開放,促進(jìn)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrialpermeability transition,MPT)發(fā)生,在加重線粒體損傷同時(shí),釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C(cytochrome C,cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。②鈣依賴性蛋白酶(Cal

5、pains)與神經(jīng)元缺氧損傷密切相關(guān)。Calpain是一類由Ca2+激活、非溶酶體來源的半胱氨酸蛋白酶。缺氧時(shí),胞內(nèi)Ca2+濃度升高激活Calpains,其可水解大量突觸功能相關(guān)蛋白如突觸蛋白(Synapsin,SYS)、細(xì)胞骨架蛋白如α-spectrin和MAP-2、微管相關(guān)蛋白tau等,直接破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能;還參與Caspase-12活化促進(jìn)Caspase-3激活,以及水解Bcl-xL的LooP結(jié)構(gòu)域,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　

6、 牛磺酸(Taurine)是體內(nèi)一種游離的小分子氨基酸,在可興奮性組織如大腦、視網(wǎng)膜、心肌等含量非常豐富。自1975年Hayes發(fā)現(xiàn)喂飼?；撬崛狈︼暳蠈?dǎo)致幼貓失明開始,?；撬嵩谝暰W(wǎng)膜的生理功能就備受關(guān)注,其不僅是視網(wǎng)膜早期分化的決定因子,還通過形成Tauret調(diào)節(jié)視黃醇代謝以及作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)參與視覺形成。近年研究還發(fā)現(xiàn),?；撬峥捎行ПＷo(hù)多種應(yīng)激狀態(tài)(缺血、缺氧、高壓、高糖等)下心肌細(xì)胞、皮質(zhì)顆粒細(xì)胞、海馬神經(jīng)元以及視網(wǎng)膜細(xì)胞,主

7、要與其抗氧化、調(diào)節(jié)滲透壓、調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等特性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室以往研究發(fā)現(xiàn),2.4％牛磺酸營養(yǎng)干預(yù)能有效防止急性低壓缺氧暴露視網(wǎng)膜?；撬岷拷档?有效保護(hù)視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞Müller細(xì)胞,但牛磺酸能否改善視網(wǎng)膜功能以及保護(hù)RGCs尚需進(jìn)一步證實(shí)。
　　 本課題體內(nèi)研究以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,?；撬釥I養(yǎng)干預(yù)14d后,采用低壓氧艙構(gòu)建模擬海拔5000m高度的急性低氧動(dòng)物模型;體外實(shí)驗(yàn)以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)化細(xì)胞RGC-5細(xì)胞為研究對象,?；撬犷A(yù)

8、處理4h后,運(yùn)用三氣培養(yǎng)箱制備RGC-5細(xì)胞低氧(5％O2)損傷模型。利用多焦視網(wǎng)膜電圖(multi-focal electroretinogram,mfERG)、中腦靶核團(tuán)逆行示蹤技術(shù)、組織及超微組織病理學(xué)、免疫熒光化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR(real time-PCR)、Western blotting等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法,觀察急性低氧視網(wǎng)膜RGCs結(jié)構(gòu)功能改變及牛磺酸對RGCs的防護(hù)效應(yīng),并探討其防護(hù)分子機(jī)制。
　　

9、 主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.急性低壓缺氧暴露24h,低氧組及?；撬岣深A(yù)組mfERG的最大混合反應(yīng)及振蕩電位(Ops)的a波、b波、OP2峰時(shí)延長、幅值降低,其中低氧組a波、b波、OP2幅值較正常對照組分別降低58.6％、56.5％、48.3％,而?；撬岣深A(yù)組a波、b波、OP2幅值顯著高于低氧組(p＜0.05),較正常對照組分別降低22.9％、34.1％、35％。急性低氧處理后7d,恢復(fù)期低氧組最大混合反應(yīng)b波、OP2幅值僅

10、達(dá)正常對照組的77.7％、81.3％(p＜0.05),而?；撬岣深A(yù)組與正常對照組無顯著性差異。以上結(jié)果說明,急性低壓缺氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能減退及RGCs電生理反應(yīng)性下降,?；撬岣深A(yù)能有效防止急性低氧誘導(dǎo)的視功能減退。
　　 2.急性低氧導(dǎo)致低氧組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)疏松,內(nèi)網(wǎng)狀層(IPL)及節(jié)細(xì)胞層(GCL)腫脹變厚,IPL內(nèi)可見Fluoro-Jade C(FJC)標(biāo)記的變性神經(jīng)元突起,超微結(jié)構(gòu)顯示低氧組IPL軸突內(nèi)線粒體腫脹、空化,

11、樹突終末微管溶解,突觸稀少,突觸小泡少;?；撬岣深A(yù)組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度較低氧組薄,FJC陽性染色弱于低氧組,IPL樹突軸突也見腫脹,但突觸復(fù)合體結(jié)構(gòu)清晰,突觸小泡較多、排列整齊。以上結(jié)果提示,急性低氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜IPL、GCL內(nèi)突觸及神經(jīng)元突起等結(jié)構(gòu)破壞,?；撬岣深A(yù)對急性低氧條件下視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)效應(yīng)。
　　 3.采用熒光金(FG)逆行示蹤技術(shù)標(biāo)記全視網(wǎng)膜RGCs發(fā)現(xiàn),急性低氧24h后,低氧組與?；撬岣深A(yù)組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)均可

12、見少量胞漿中FG分布不均勻的RGCs以及吞噬了FG的分枝型小膠質(zhì)細(xì)胞,提示RGCs損傷。TUNEL染色結(jié)果顯示,低氧組及?；撬岣深A(yù)組內(nèi)核層(INL)、GCL內(nèi)可見散在的TUNEL陽性細(xì)胞,?；撬岣深A(yù)組RGCs凋亡指數(shù)顯著低于低氧組(1.3±0.2％ vs.2.4±0.5％;p＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨低氧時(shí)間延長,RGC-5細(xì)胞逐漸皺縮、變圓及脫落,細(xì)胞活力下降,LDH釋放率升高,細(xì)胞凋亡率上升,低氧24h、48h細(xì)胞凋亡率分別為(

13、17.75±3.95)％和(47.59±6.70)％;牛磺酸預(yù)處理(0.01mM、0.1mM、1mM)可有效提高細(xì)胞存活率,其中0.1mM牛磺酸濃度最為有效,低氧48h?；撬犷A(yù)處理組細(xì)胞凋亡率僅為(17.14±5.14)％。以上結(jié)果提示,急性低壓缺氧導(dǎo)致RGCs變性凋亡,而?；撬岣深A(yù)能有效減少急性低氧誘導(dǎo)的RGCs丟失。
　　 4.體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),正常視網(wǎng)膜內(nèi)Calpain-2呈低表達(dá)、低活性狀態(tài);急性低氧24h后,低氧組視網(wǎng)膜全

14、層尤其是IPL和RGCs內(nèi)高表達(dá)Calpain-2、酶活性增強(qiáng),而?；撬岣深A(yù)組Calpain-2表達(dá)量及酶活性均低于低氧組(p＜0.05)。突觸蛋白、α-Spectrin、tau是Calpain-2酶解特異底物,急性低氧暴露后各組視網(wǎng)膜上述蛋白表達(dá)均降低,而?；撬岣深A(yù)組高于低氧組(p＜0.05)。體外研究也發(fā)現(xiàn),?；撬犷A(yù)處理組可降低低氧條件RGC-5細(xì)胞內(nèi)Calpain-2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)及酶活性,以及減少α-Spectrin、tau

15、降解。以上結(jié)果提示,牛磺酸可通過降低急性低氧誘導(dǎo)的Calpain-2表達(dá)及活化,進(jìn)而抑制Calpain-2介導(dǎo)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能相關(guān)蛋白降解,有效保護(hù)視網(wǎng)膜及RGCs功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 5.體外研究發(fā)現(xiàn),隨低氧時(shí)間延長RGC-5細(xì)胞[Ca2+]i逐漸升高、谷胱甘肽(GSH)含量逐漸減少,低氧處理24h后RGC-5細(xì)胞大量MPTP開放,反映線粒體膜電位(△Ψm)的JC-1紅/綠熒光比值下降,ATP含量顯著下降,胞漿內(nèi)cyt C

16、及Caspase-3活性亞基(17kDa)含量顯著上升,可見AIF核轉(zhuǎn)位;?；撬犷A(yù)處理能有效拮抗低氧誘導(dǎo)的[Ca2+]i上升和GSH耗竭,與低氧組相比,低氧處理24h后RGC-5細(xì)胞MPTP開放程度低,JC-1紅/綠熒光比值高,ATP含量高于低氧組(7.89±1.25 vs.4.64±1.03 nmol/mg prot;p＜0.05),胞漿內(nèi)cyt C、Caspase-3活性亞基(17kDa)以及核內(nèi)AIF含量高于低氧組。體外研究也發(fā)現(xiàn)

17、,急性低壓缺氧24h后,低氧組與?；撬岣深A(yù)組視網(wǎng)膜Caspase-3活性亞基(17 kDa)以及SBDP120kDa含量增加,但?；撬岣深A(yù)組顯著低于低氧組(p＜0.05)。以上結(jié)果提示,牛磺酸可通過維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、抗氧化,調(diào)節(jié)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放,進(jìn)而防止MPT引發(fā)的線粒體功能障礙,下調(diào)線粒體Cyt C/Caspase-3以及不依賴于Caspase的AIF凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo),對視網(wǎng)膜神經(jīng)元及RGCs發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。
　　 綜上所述,