急性低壓缺氧視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷及?；撬岱雷o效應研究.pdf

1、低壓缺氧(hypobaric hypoxia,HBH)是海拔大于3000m地區(qū)如高山、高原、高空等的重要環(huán)境因素。視網(wǎng)膜是對缺氧高度敏感的神經(jīng)組織,未經(jīng)習服者進入低壓缺氧環(huán)境則會出現(xiàn)暗適應時間延長、視力下降、色覺減退等視功能障礙,嚴重者出現(xiàn)眼底病改變甚至失明。以往研究認為急性低壓缺氧視網(wǎng)膜功能障礙主要是視網(wǎng)膜內動靜脈失代償性擴張、視乳頭水腫、眼底出血等所致,而對視網(wǎng)膜神經(jīng)元形態(tài)結構功能變化的報道甚少。視網(wǎng)膜主要由光感受器-雙極細胞-神經(jīng)

2、節(jié)細胞三級神經(jīng)元組成,研究發(fā)現(xiàn),急性低壓缺氧早期反映視網(wǎng)膜內層神經(jīng)元功能的振蕩電位(oscillatory potentials,Ops)異常,以及模擬高原缺氧大鼠視網(wǎng)膜內層結構疏松、變厚等現(xiàn)象,提示急性低壓缺氧視網(wǎng)膜內層神經(jīng)元結構功能損害。神經(jīng)節(jié)細胞(Retina ganglion cells,RGCs)位于視網(wǎng)膜內層,是視覺信息傳遞的重要中繼神經(jīng)元,其通過樹突和胞體上的突觸收集來自雙極細胞的視覺信號,經(jīng)過整合后以動作電位沿軸突即視神

3、經(jīng)快速傳遞至視覺中樞,RGCs損傷勢必導致視覺功能障礙,因此,深入認識急性低壓缺氧暴露時RGCs結構與功能變化及其病理機制,并尋找合適的防護劑具有重要意義。
　　 針對神經(jīng)元缺氧損傷可能的病理機制,國內外已進行大量研究,主要認為:①線粒體功能障礙是神經(jīng)元缺氧損傷的中心環(huán)節(jié)。缺氧條件下,一方面,線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián),細胞能量ATP供應不足,可干擾神經(jīng)元細胞膜上Na+、K+離子通道以及受體特性,影響神經(jīng)元電生理功能實現(xiàn);另一方面,

4、線粒體通透性轉換孔(mitochondrialpermeability transition pore,MPTP)異常開放,促進線粒體膜通透性轉換(mitochondrialpermeability transition,MPT)發(fā)生,在加重線粒體損傷同時,釋放促凋亡因子如細胞色素C(cytochrome C,cyt C)、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF),啟動細胞凋亡。②鈣依賴性蛋白酶(Cal

5、pains)與神經(jīng)元缺氧損傷密切相關。Calpain是一類由Ca2+激活、非溶酶體來源的半胱氨酸蛋白酶。缺氧時,胞內Ca2+濃度升高激活Calpains,其可水解大量突觸功能相關蛋白如突觸蛋白(Synapsin,SYS)、細胞骨架蛋白如α-spectrin和MAP-2、微管相關蛋白tau等,直接破壞神經(jīng)元結構及功能;還參與Caspase-12活化促進Caspase-3激活,以及水解Bcl-xL的LooP結構域,促進細胞凋亡。
　　

6、 ?；撬?Taurine)是體內一種游離的小分子氨基酸,在可興奮性組織如大腦、視網(wǎng)膜、心肌等含量非常豐富。自1975年Hayes發(fā)現(xiàn)喂飼?；撬崛狈︼暳蠈е掠棕埵鏖_始,?；撬嵩谝暰W(wǎng)膜的生理功能就備受關注,其不僅是視網(wǎng)膜早期分化的決定因子,還通過形成Tauret調節(jié)視黃醇代謝以及作為抑制性神經(jīng)遞質參與視覺形成。近年研究還發(fā)現(xiàn),?；撬峥捎行ПＷo多種應激狀態(tài)(缺血、缺氧、高壓、高糖等)下心肌細胞、皮質顆粒細胞、海馬神經(jīng)元以及視網(wǎng)膜細胞,主

7、要與其抗氧化、調節(jié)滲透壓、調節(jié)胞內鈣穩(wěn)態(tài)等特性有關。本實驗室以往研究發(fā)現(xiàn),2.4％?；撬釥I養(yǎng)干預能有效防止急性低壓缺氧暴露視網(wǎng)膜牛磺酸含量降低,有效保護視網(wǎng)膜膠質細胞Müller細胞,但?；撬崮芊窀纳埔暰W(wǎng)膜功能以及保護RGCs尚需進一步證實。
　　 本課題體內研究以SD大鼠為實驗對象,?；撬釥I養(yǎng)干預14d后,采用低壓氧艙構建模擬海拔5000m高度的急性低氧動物模型;體外實驗以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)轉化細胞RGC-5細胞為研究對象,牛磺酸預

8、處理4h后,運用三氣培養(yǎng)箱制備RGC-5細胞低氧(5％O2)損傷模型。利用多焦視網(wǎng)膜電圖(multi-focal electroretinogram,mfERG)、中腦靶核團逆行示蹤技術、組織及超微組織病理學、免疫熒光化學法、流式細胞術、實時定量PCR(real time-PCR)、Western blotting等多種實驗技術方法,觀察急性低氧視網(wǎng)膜RGCs結構功能改變及牛磺酸對RGCs的防護效應,并探討其防護分子機制。
　　

9、 主要結果和結論如下:
　　 1.急性低壓缺氧暴露24h,低氧組及?；撬岣深A組mfERG的最大混合反應及振蕩電位(Ops)的a波、b波、OP2峰時延長、幅值降低,其中低氧組a波、b波、OP2幅值較正常對照組分別降低58.6％、56.5％、48.3％,而?；撬岣深A組a波、b波、OP2幅值顯著高于低氧組(p＜0.05),較正常對照組分別降低22.9％、34.1％、35％。急性低氧處理后7d,恢復期低氧組最大混合反應b波、OP2幅值僅

10、達正常對照組的77.7％、81.3％(p＜0.05),而?；撬岣深A組與正常對照組無顯著性差異。以上結果說明,急性低壓缺氧導致視網(wǎng)膜功能減退及RGCs電生理反應性下降,?；撬岣深A能有效防止急性低氧誘導的視功能減退。
　　 2.急性低氧導致低氧組大鼠視網(wǎng)膜組織結構疏松,內網(wǎng)狀層(IPL)及節(jié)細胞層(GCL)腫脹變厚,IPL內可見Fluoro-Jade C(FJC)標記的變性神經(jīng)元突起,超微結構顯示低氧組IPL軸突內線粒體腫脹、空化,

11、樹突終末微管溶解,突觸稀少,突觸小泡少;?；撬岣深A組視網(wǎng)膜內層厚度較低氧組薄,FJC陽性染色弱于低氧組,IPL樹突軸突也見腫脹,但突觸復合體結構清晰,突觸小泡較多、排列整齊。以上結果提示,急性低氧導致視網(wǎng)膜IPL、GCL內突觸及神經(jīng)元突起等結構破壞,牛磺酸干預對急性低氧條件下視網(wǎng)膜形態(tài)結構具有一定的保護效應。
　　 3.采用熒光金(FG)逆行示蹤技術標記全視網(wǎng)膜RGCs發(fā)現(xiàn),急性低氧24h后,低氧組與牛磺酸干預組大鼠視網(wǎng)膜內均可

12、見少量胞漿中FG分布不均勻的RGCs以及吞噬了FG的分枝型小膠質細胞,提示RGCs損傷。TUNEL染色結果顯示,低氧組及?；撬岣深A組內核層(INL)、GCL內可見散在的TUNEL陽性細胞,?；撬岣深A組RGCs凋亡指數(shù)顯著低于低氧組(1.3±0.2％ vs.2.4±0.5％;p＜0.05)。體外實驗發(fā)現(xiàn),隨低氧時間延長,RGC-5細胞逐漸皺縮、變圓及脫落,細胞活力下降,LDH釋放率升高,細胞凋亡率上升,低氧24h、48h細胞凋亡率分別為(

13、17.75±3.95)％和(47.59±6.70)％;?；撬犷A處理(0.01mM、0.1mM、1mM)可有效提高細胞存活率,其中0.1mM?；撬釢舛茸顬橛行?低氧48h牛磺酸預處理組細胞凋亡率僅為(17.14±5.14)％。以上結果提示,急性低壓缺氧導致RGCs變性凋亡,而?；撬岣深A能有效減少急性低氧誘導的RGCs丟失。
　　 4.體內試驗發(fā)現(xiàn),正常視網(wǎng)膜內Calpain-2呈低表達、低活性狀態(tài);急性低氧24h后,低氧組視網(wǎng)膜全

14、層尤其是IPL和RGCs內高表達Calpain-2、酶活性增強,而?；撬岣深A組Calpain-2表達量及酶活性均低于低氧組(p＜0.05)。突觸蛋白、α-Spectrin、tau是Calpain-2酶解特異底物,急性低氧暴露后各組視網(wǎng)膜上述蛋白表達均降低,而?；撬岣深A組高于低氧組(p＜0.05)。體外研究也發(fā)現(xiàn),牛磺酸預處理組可降低低氧條件RGC-5細胞內Calpain-2 mRNA轉錄表達及酶活性,以及減少α-Spectrin、tau

15、降解。以上結果提示,牛磺酸可通過降低急性低氧誘導的Calpain-2表達及活化,進而抑制Calpain-2介導的神經(jīng)元結構及功能相關蛋白降解,有效保護視網(wǎng)膜及RGCs功能和形態(tài)結構。
　　 5.體外研究發(fā)現(xiàn),隨低氧時間延長RGC-5細胞[Ca2+]i逐漸升高、谷胱甘肽(GSH)含量逐漸減少,低氧處理24h后RGC-5細胞大量MPTP開放,反映線粒體膜電位(△Ψm)的JC-1紅/綠熒光比值下降,ATP含量顯著下降,胞漿內cyt C

16、及Caspase-3活性亞基(17kDa)含量顯著上升,可見AIF核轉位;?；撬犷A處理能有效拮抗低氧誘導的[Ca2+]i上升和GSH耗竭,與低氧組相比,低氧處理24h后RGC-5細胞MPTP開放程度低,JC-1紅/綠熒光比值高,ATP含量高于低氧組(7.89±1.25 vs.4.64±1.03 nmol/mg prot;p＜0.05),胞漿內cyt C、Caspase-3活性亞基(17kDa)以及核內AIF含量高于低氧組。體外研究也發(fā)現(xiàn)

17、,急性低壓缺氧24h后,低氧組與?；撬岣深A組視網(wǎng)膜Caspase-3活性亞基(17 kDa)以及SBDP120kDa含量增加,但?；撬岣深A組顯著低于低氧組(p＜0.05)。以上結果提示,?；撬峥赏ㄟ^維持胞內鈣穩(wěn)態(tài)、抗氧化,調節(jié)線粒體膜通透性轉換孔開放,進而防止MPT引發(fā)的線粒體功能障礙,下調線粒體Cyt C/Caspase-3以及不依賴于Caspase的AIF凋亡信號轉導,對視網(wǎng)膜神經(jīng)元及RGCs發(fā)揮保護效應。
　　 綜上所述,