大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文通過建立穩(wěn)定的大鼠慢性高眼壓模型，研究青光眼視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞病理改變及其在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷中的作用，并對青光眼中視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細胞選擇性損傷機制進行初步探討。 主要研究方法及內(nèi)容 1．用結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5一Fu的方法建立大鼠慢性高眼壓模型。 2．在模型建立后2小時、12小時、1天、1周、4周、8周，分別取4只高眼壓組、假手術(shù)組及正常組大鼠眼球，冰凍切片行免疫組織化學染色，在激光共聚焦顯微鏡

2、下觀察視網(wǎng)膜GFAP表達的情況。 3．在模型建立后2小時、12小時、1天、l周、4周、8周，分別取4只高眼壓組及正常大鼠分別在視網(wǎng)膜鋪片上進行GFAP染色，，行星型膠質(zhì)細胞計數(shù)并觀察其形態(tài)。 4．在模型建立后2小時、12小時、1天、1周、4周、8周，分別取4只高眼壓組、假手術(shù)組及正常大鼠鼻側(cè)一半視網(wǎng)膜，在鋪片上行OX42染色，進行小膠質(zhì)細胞計數(shù)并觀察其形態(tài)；取剩余的顳側(cè)中周部視網(wǎng)膜，半薄切片行甲苯胺藍染色進行Mailer

3、計數(shù)。 5．在模型建立后1月，作眼球冰凍切片，行免疫組織化學染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜TNF-a-GFAP、TNF-a-OX42、TNFR-1-GFAP以及TNFR-1-NeuN的雙標染色情況。 6．模型建立后1周、4周，在視網(wǎng)膜鋪片上行免疫組織化學染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜GluR2以及NF-68的表達情況。 主要研究結(jié)果 1．結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5-Fu可誘導較長時間

4、穩(wěn)定高眼壓，10周內(nèi)130只眼中有112只眼眼壓大于22mmHg，成模率為86．15％；眼壓升高1周、4周、6周、10周后，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活率分別為：90．16％，83．50％，75．01％．62．37％。 2．高眼壓模型建立后2小時，就有活化的小膠質(zhì)細胞出現(xiàn)，一周后活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量達到高峰，以后逐漸減少。 3．高眼壓模型建立后12小時，星型膠質(zhì)細胞以及Miiller細胞開始呈現(xiàn)活化狀態(tài)，4周后兩者的活化達到高

5、峰，以后逐漸下降；并且活化的星型膠質(zhì)細胞在結(jié)構(gòu)上有明顯異常。與正常組相比，慢性高眼壓組視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細胞以及Miiller的數(shù)量沒有明顯變化。 4．TNF-α、GFAP抗體的免疫組化雙標染色：正常大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細胞層的星型膠質(zhì)細胞GFAP染色呈弱陽性，整個視網(wǎng)膜未見明顯TNF．α陽性染色，1個月高眼壓大鼠除視網(wǎng)膜內(nèi)界膜下、神經(jīng)節(jié)細胞層星型膠質(zhì)細胞GFAP染色增強外，其余各層也可見絲條狀貫穿于內(nèi)外界膜之間的GFAP陽性

6、染色，其形狀與M(iller細胞的形狀相似，并且在上述部位有GFAP及TNF．α的共表達。 5．TNF．a(chǎn)、OX42抗體的免疫組化雙標染色：正常大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞有OX42的微弱表達，胞體小，分支細、長，主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層以及內(nèi)叢狀層，整個視網(wǎng)膜未見TNF-a陽性染色；1個月高眼壓大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞OX42染色變深，胞體變大，分支變粗，但分布仍主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層以及內(nèi)

7、叢狀層，并且在上述部位有OX42、TNF．Q的共表達。 6．TNF-R1、GFAP抗體雙標染色：正常大鼠視網(wǎng)膜未見明顯TNF-R1染色；在慢性高眼壓情況下，TNF-R1在視網(wǎng)膜內(nèi)層的表達較正常對照組增加，并且在視網(wǎng)膜內(nèi)層，TNF-R1與GFAP有共表達。 7．TNF-R1、NeuNIgG抗體雙標染色：正常大鼠視網(wǎng)膜未見明顯TNF-R染色；同樣，在慢性高眼壓情況下，TNF-R1在視網(wǎng)膜內(nèi)層的表達較正常對照組增加，但TNF-

8、R1與神經(jīng)節(jié)細胞層NeuN(神經(jīng)元特異性核蛋白)沒有共表達。 8．NF-68免疫組化染色：在正常對照組及高眼壓組，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層大、中、小直徑的神經(jīng)節(jié)細胞均可表達NF-68，但NF-68在大直徑的神經(jīng)節(jié)細胞的表達更為明顯。 9．NF-68及GluR2抗體的免疫組化雙標染色：在正常對照組，大鼠視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細胞均缺乏GluR2的表達，而中、小直徑神經(jīng)節(jié)細胞大都可表達GluR2；在高眼壓1W以及1M，中、小直徑神經(jīng)節(jié)細胞

9、GluR2的表達沒有明顯變化；在高眼壓1W，NF-68陽性的大直徑的神經(jīng)節(jié)細胞仍缺乏GluR2的表達；但到高眼壓1M，殘存NF-68陽性的大直徑的神經(jīng)節(jié)細胞開始表達GluR2。 結(jié)論 1．結(jié)扎上鞏膜靜脈聯(lián)合術(shù)后球結(jié)膜下注射5-Fu誘導的慢性高眼壓模型具有操作簡單，重復性好，成模率高，高眼壓可穩(wěn)定維持較長時間等優(yōu)點，是較為理想的大鼠慢性高眼壓模型。 2．在慢性高眼壓情況下，視網(wǎng)膜三種膠質(zhì)細胞(星型膠質(zhì)細胞、Mail

10、er細胞、小膠質(zhì)細胞)均存在活化現(xiàn)象；活化的星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞還伴有明顯細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。 3．小膠質(zhì)細胞可能是視網(wǎng)膜最早發(fā)生病理改變的部位。 4．在慢性高眼壓情況中，活化的視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞(包括星型膠質(zhì)細胞、Mailer細胞以及小膠質(zhì)細胞)TNF-α的表達明顯增加。 5．在慢性高眼壓情況中，視網(wǎng)膜內(nèi)層膠質(zhì)細胞TNFR．1表達增加。 6．正常大鼠視網(wǎng)膜大神經(jīng)節(jié)細胞均缺乏GIuR2亞單位表達。